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腺病毒介导的CTLA4Ig基因对共同导入的BDNF基因在大鼠脊髓表达的影响

王保宁  
【摘要】: 目的:脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor BDNF)作为神经营养因(neurotrophic factors NTF)家族的第二成员,是一种主要由脑组织合成、能够维持中枢神经系统多种神经元存活及促进神经轴突生长的碱性蛋白。BDNF基因在正常的大鼠脊髓中也有少量表达,当脊髓受损伤后局部的组织细胞表达BDNF升高,可以促进脊髓神经元功能恢复,但表达量不稳定,时间较短。应用复制缺陷型重组腺病毒(Adenovirus AdV)为载体导入神经营养因子的基因治疗,已成为神经修复研究领域研究重点课题。但神经营养因子导入后机体往往将其看做为异体抗原引发免疫反应,成为应用神经因子基因治疗的影响因素之一。本实验将携带BDNF基因的AdV (AdBDNF)与不带外源基因的Ad0或与携带细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4immunoglobulin,CTLA4Ig )基因的AdV (AdCTLA4Ig)两种腺病毒混悬液通过微量注射导入大鼠腰膨大脊髓实质内,比较两组BDNF基因在脊髓前角表达的情况,以探讨腺病毒介导的CTLA4Ig基因对共同导入的BDNF基因表达的影响。 方法:选用7周龄健康Wistar大鼠98只,体重200-250g。将大鼠随机分成三组:正常对照组(A组)为正常大鼠,不导入腺病毒;实验对照组(B组)导入Ad0+AdBDNF;实验组(C组)导入AdCTLA4Ig +AdBDNF。将实验对照组及实验组大鼠经腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻醉(75-100mg/kg+5mg/kg),麻醉成功后固定于脑立体定位仪上。取长约2cm后正中切口,去除T13椎板,暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-III型手动推进器,于脊髓后正中动脉右侧0.8mm处注射Ad0(5×109pfu/ml)与AdBDNF(1×109 pfu/ml)的混悬液2μl(B组)或AdBDNF(1×109 pfu/ml)与AdCTLA4Ig(1×109 pfu/ml) 2μl(C组)。针尖向头侧呈45度斜行进针,斜行刺入深度为2.5mm。注射速度为1μl/min,注射完毕后滞针5min,缓慢拔针。充分止血、冲洗伤口,局部喷洒抗生素预防感染,关闭伤口。B、C组大鼠转染病毒后2天、4天、7天、15天、30天、45天、60天取材,标本为大鼠脊髓。对三组大鼠脊髓进行厚40μm的连续冰冻横切片经行免疫组织化学染色,计数三组中不同时间点BDNF在脊髓前角运动神经元染色阳性的细胞计数及BDNF免疫阳性产物积分光密度值(IOD)测定,采用免疫荧光染色检测AdCTLA4Ig持续表达时间并采用多聚酶链反应(PCR)监测B、C两组病毒注入脊髓的存活时间,及逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法检测三组BDNF基因在大鼠脊髓中表达的情况。 结果: 1 BDNF, CTLA4Ig的转基因表达 1.1 CTLA4Ig转基因表达:实验组术后两天可见到免疫阳性细胞,可持续到术后45天随时间推移于术后60天无免疫阳性细胞出现。 1.2 BDNF转基因表达:在正常对照组(A组),大鼠脊髓的腹角运动神动元和脊髓后角感觉神经元及部分胶质细胞中可见少量BDNF阳性细胞,其阳性产物亚细胞定位主要分布于细胞浆。实验对照组及实验组阳性细胞多存在于注射侧的脊髓前角运动神经元和周围的胶质细胞。实验对照组(B组)导入Ad0+AdBDNF后BDNF阳性染色细胞数及免疫阳性产物的积分光密度值(IOD)明显增加并于术后7天达到高峰随时间推移30天时表达量已接近正常对照组,实验组(C组)导入CTLA4Ig+AdBDNF后BDNF阳性染色细胞数及免疫阳性产物的积分光密度值(IOD)明显增加并同样于术后7天达到高峰且表达量高于正常组(A组)及实验组(B组)但高峰持续时间明显延长于60天时表达量同正常组(A组)及实验组(B组)无明显差异。统计学分析表明:三组BDNF阳性染色细胞数及免疫阳性产物的积分光密度值(IOD)在4天、7天、15天、30天、45天均存在显著统计学差异(P0.05),BDNF阳性染色细胞数及免疫阳性产物积的分光密度值(IOD)在2天及60天三组之间无显著统计学差异(P0.05)。 2 PCR检测: 2.1腺病毒液PCR检测:腺病毒的表达量随着浓度的降低而逐渐减小。采用病毒液10倍系列稀释提取后DNA经PCR反应可检测出腺病毒的特异性条带的最低稀释度为10-4,AdlacZ(1×109pfu/ml)与Ad0(5×109 pfu/ml)特异性条带的最低稀释度一致。 2.2脊髓标本腺病毒PCR的检测:用PCR法从DNA水平分别检测腺病毒在实验对照组、实验组的脊髓标本中存活时间。腺病毒的DNA量是随时间延长逐渐下降的,实验对照组(B)组至45天而实验组至第60天均检测不到腺病毒的表达。 3 RT-PCR检测: 3.1 BDNFmRNA在大鼠脊髓组织的表达:用RT-PCR法从mRNA水平分别检测BDNF在对照组、实验对照、实验组的表达情况:转染2天后三组均可检测出BDNFmRNA在大鼠脊髓组织的表达,实验对照组及实验组表达上调高峰均为术后7天,实验组及实验对照组高表达量可以持续30天及15天,对照组到第45天完全消失。实验组到第60天完全消失。统计学分析表明两组之间在高峰期间BDNFmRNA表达量有显著差异(P0.05),组内不同时间点比较BDNFmRNA表达量有显著差(P0.05)。 3.2 CTLA4IgmRNA在大鼠脊髓组织的表达:用RT-PCR法从mRNA水平分别检测CTLA4IgmRNA在实验组的表达情况。转染2天后实验组可检测出CTLA4IgmRNA在大鼠脊髓组织的表达,表达上调高峰为术后4-7天,高表达量可以持续到2周,到第45天完全消失。 结论:在正常Wistar大鼠脊髓中,有少量的BDNF染色阳性细胞及微量的BDNFmRNA表达。实验组将AdV介导的CTLA4Ig基因注射入脊髓能有效地抑制局部T淋巴细胞的浸润,从而减轻由AdV介导的局部炎症反应,抑制机体对病毒载体的排斥反应,显著延长共同导入的BDNF基因在脊髓的表达时间,并且增强与其共同导入的BDNF基因表达强度。


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