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豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流和动作电位在生长发育过程中的变化

朱晓冉  
【摘要】: 心肌细胞膜上的离子通道是维持心脏正常电活动的物质基础,其结构和/或功能的异常称心脏离子通道病(cardiac channelopathies),包括基因突变所致的遗传性离子通道病和后天获得性离子通道病,后者见于疾病(如各种原因导致的心肌肥厚、心衰)引发的通道功能改变、药物抑制心肌通道等。通道功能紊乱常引发心律失常,影响心脏的泵血功能,严重者可致心脏性猝死(Sudden cardiac death, SCD),是人类死亡的重要原因,因此研究心脏离子通道正常生理功能调节和病理变化具有重要的意义。 以往的研究表明,不同种属动物心脏离子通道的组成和分布情况存在着差异,而心脏各离子通道在动物生长发育过程中的变化也并不相同,这就造成了生长发育过程中动作电位波形和时程(APD)处于不断的发展变化中。此外,随着年龄的增长,复极化重要离子电流的电流幅值、电流密度、通道动力学、门控特点等诸多电生理特性发生改变,造成心肌动作电位形状和时程发生改变。因此年龄作为影响心肌离子通道功能的重要因素之一引起了研究者的高度重视。 心室复极化的各种钾电流是决定动作电位时程的主要电流成分,主要包括瞬时外向钾电流(Ito)、延迟整流钾电流(IK)及内向整流钾电流(IK1)等。研究表明,啮齿类动物在从幼年到成年的发育过程中瞬时外向钾电流Ito电流密度不断增大,同时伴随通道蛋白Kv4.2/Kv4.3表达的增加;而主要调节静息电位的内向整流钾电流(IK1)由于受细胞内的多胺类物质,如精胺和精脒的调控在动物发育过程中也呈增加趋势。发育过程中上述复极化钾电流改变也使得动作电位时程(APD)缩短,静息膜电位(RP)值增大。 参与心室复极化的钾电流存在着明显的种属差异,Ito是小动物,如小鼠、大鼠心室肌细胞主要的复极电流,延迟整流钾电流(IK)是则是包括人类在内大动物心室复极化的主要电流成分。按照通道动力学的不同将IK区分为快激活成分(IKr)和慢激活成分(IKs) ,其中,human ether-a-go-go-related基因(HERG)编码人IKr通道的孔区α亚单位,KCNQ1基因编码IKs通道的α亚单位,KCNE2和KCNE1基因分别编码IKr和IKs的β亚单位,IKr和IKs在心室复极过程中发挥至关重要的作用。豚鼠作为目前研究IKr和IKs的常用动物,迄今尚不清楚发育过程中动作电位及IKr和IKs的变化。 本研究采用膜片钳技术,观察了延迟整流钾电流和动作电位在豚鼠从幼年到成年的发育过程中的变化规律,从而为进一步研究通道功能的生理调节打下基础。 一豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流(Ik)在生长发育过程中的变化 目的:观察健康豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流(Ik)及其两种主要成分在动物生长发育过程中的变化。 方法:(1)豚鼠心室肌细胞分离:健康豚鼠按年龄不同分为2天组(Day-2)、2周组(Day-14)及成年组(adult)。10%的肝素0.1ml/10g腹腔注射10分钟后,戊巴比妥钠(0.1g/kg)腹腔麻醉。迅速取下心脏,经主动脉进行Langendorff逆行灌流,流速2ml/min。在37℃下用100% O2饱和的无钙台氏液灌流约5分钟,台氏液(组成mM/L:NaCl 140、KCl 5.4、MgCl2 1、Glucose 10、HEPES 10,用NaOH调PH值至7.4),之后用含0.4g/LⅡ型胶原酶的无钙台氏液循环灌流5~15 min,当心脏变得柔软、松弛时用无钙台氏液冲洗5 min以终止反应,取下心脏。取左心室游离壁中层细胞保存于KB液(组成mM/L:KOH 80、KCl 40、KH2PO4 25、MgSO4 3、L-glutamic acid 50、taurine 20、EGTA1、Glucose 10、HEPES 10,用KOH调PH值至7.2)中。为保证保证所得实验数据稳定、重复性好,细胞分离后6~8小时内用于电生理记录。 (2)钾电流记录:采用全细胞膜片钳技术室温(23℃~25℃)下记录不同年龄段豚鼠心肌细胞的延迟整流钾电流。电极外液(组成mM/L:NaCl 132、KCl 4、MgCl2 1.2、CaCl2 1.8、Glocose 5、HEPES 10,用NaOH调PH值至7.4),电极内液(组成mM/L:KCl 140、Mg-ATP 4、MgCl2 1、EGTA 5、HEPES 10,用KOH调PH值至7.2)。向外液中加入尼莫地平(Nim, 1μM),阻断L-型Ca2+通道,保持膜电位在-40 mV使Na+通道和T-型Ca2+通道失活。在电压钳模式下,首先从-40 mV开始以阶跃电压10 mV的方式去极化到+50 mV,维持3000 ms,引出Ik,而后保持-40 mV 2000 ms记录迟延整流钾电流的尾电流(IK-tail),随后给予2μM E-4031,特异性阻断快激活的延迟整流钾电流IKr,记录IKs。用IK-tail-IKs-tail得到Ik的快激活成分(IKr)的大小。以钳制电压为-50 mV,超级化-10 mV得到的细胞电容电流积分值,计算出细胞电容,再用pA/pF求得电流密度。 结果:(1)豚鼠在2天、2周及成年三个阶段的发育过程中,延迟整流钾电流Ik的电流密度在电压为+50 mV时分别为:1.72±0.12、2.86±0.16、3.95±0.18(pA/pF),即呈逐渐递增式变化,三组数据间均有显著性差别P0.05)。 (2)在2天、2周及成年三个阶段的发育过程中,延迟整流钾电流慢激活成分Iks在+50 mV时电流密度分别为:1.18±0.12、1.95±0.19、3.08±0.19(pA/pF),统计学比较三组数据间均有统计学意义(P0.05)。不同阶段Iks分别占总Ik的比例分别为67.7%、67.7%、77.8%。 (3)在2天、2周及成年三个阶段的发育过程中,延迟整流钾电流快激活成分IKr在+50 mV时电流密度分别为0.55±0.14、0.91±0.16、0.88±0.15(pA/pF)。统计学分析,2周龄豚鼠IKr的电流密度较2天明显增加,而从2周到成年的发育过程中,IKr的电流密度未见明显改变(P0.05)。 小结:(1)延迟整流钾电流(IK)在豚鼠从新生到成年的发育过程中电流密度逐渐增大。 (2) Ikr的发育主要是在新生到2周这个阶段,2周即达到成年水平,而其慢激活成分Iks则从出生后持续发育直至成年,两种电流成分不同的增长方式提示发育过程中存在不同的通道调节因素。 二豚鼠心室肌细胞动作电位(AP)在生长发育过程中的变化 目的:观察健康豚鼠心室动作电位在生长发育过程中的变化。 方法:(1)豚鼠心室肌细胞分离:方法同第一部分。 (2)打孔式动作电位记录:玻璃微电极由自动拉制仪制备,充灌电极内液后的电极电阻为1~3 M?。先用电极尖部充以少量不含两性霉素的电极内液,再用含两性霉素(终浓度600ng/ml)的电极内液充灌电极,用微电极操纵器将电极推向细胞,负压吸引形成高阻封接,5-10分钟后转到电流钳下,静息膜电位在-70mV以上的细胞予以波宽10 ms,1Hz的方波,100% ~ 120%阈电流诱导动作电位,静息膜电位达不到-70mV的细胞弃去不用。计算动作电位参数,包括静息电位、动作电位幅值、复极化90%需要的时间APD90等。 结果:(1)在1 Hz的刺激频率下,2天、14天及成年豚鼠心室肌细胞静息电位分别为-80.1±1.5、-81.6±1.8、-78.9±1.3 (mV)。三组间无统计学差别(P0.05); (2) 2天、14天及成年豚鼠心室肌细胞动作电位幅值分别为127.9±2.1、129.3±3.0、131.7±2.5 (mV),三组间无统计学差别(P0.05); (3) 2天、14天及成年豚鼠心室肌细胞的APD90分别为159.7±9.8、188.4±14.3、203.8±12.8 (ms),即APD90随动物年龄的增长逐渐延长。各组间比较P0.05。由于复极化的延迟整流钾电流在发育过程中逐渐增加,这种豚鼠心室动作电位逐渐延长提示内向电流成分在发育过程中的明显上调。 结论:(1)尽管豚鼠从出生到成年发育过程中复极钾电流增加,动作电位却逐渐延长,提示内向电流成分在发育过程中的明显上调。 (2)豚鼠心室肌细胞动作电位幅值和静息膜电位没有明显的改变。


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