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肝癌HepG2细胞IER5基因高表达细胞系的建立及其辐射效应研究

杨芬  
【摘要】: 原发性肝癌(简称肝癌)是我国常见恶性肿瘤,新发肝癌病例中55%在我国,诊治形式十分严峻,临床研究证实三维适形放疗是肝癌治疗的有力武器。辐射敏感性是影响肿瘤放疗效果的重要因素,辐射敏感与辐射敏感基因有关。如果某基因在辐射后出现表达变化,这种表达变化能够促进肿瘤细胞凋亡或抑制肿瘤细胞生长,那么该基因就可能为肿瘤的辐射敏感基因。本课题组的前期研究显示:辐射可引起早期反应基因IER5 mRNA表达上调,人肝癌细胞IER5基因对辐射异常敏感,在4Gy辐射后其mRNA水平为未辐射细胞的11.54倍。国外文献揭示IER5基因与细胞分裂、细胞凋亡有关。这就提示我们IER5基因可能与肝癌的辐射敏感性有关。 本研究旨在探索IER5基因在肝癌发生发展中的生物学功能及其辐射敏感性。为了深入研究肝癌细胞IER5基因的辐射生物学功能,就有必要探索IER5基因高表达及基因沉默对细胞辐射效应的影响。稳定高表达(定义)是指将外源基因导入靶细胞的技术,常用的基因转染技术是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内,并在细胞内表达。建立稳定的细胞系,根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物,对靶细胞进行筛选,最常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素(hygromycin)和新霉素(neomycin),筛选后得到稳定表达外源基因的单克隆细胞。本实验以人肝癌HepG2细胞为研究对象,构建IER5基因高表达细胞系,研究IER5基因在肝癌发生发展中的生物学功能及辐射效应。同期实验组其他成员采用RNA干扰技术,转染HepG2细胞,建立IER5基因表达抑制细胞模型,研究基因表达抑制后对应参数的变化。两者对比结合,从基因水平探索IER5基因与肝癌辐射有关的生物学功能,探求IER5基因是否为肝癌的辐射敏感基因,能否成为肝癌放疗中一个潜在增敏靶点,为今后分子靶向治疗药物的研发提供理论指导。 目的:本课题选择离体肝癌HepG2细胞作为研究对象,采用稳定转染筛选单克隆技术,转染HepG2,建立IER5基因过表达细胞模型,探讨IER5基因过表达对HepG2细胞增殖、细胞周期、辐射效应及细胞凋亡的影响,进一步探讨该基因的生物学功能,探求该基因是否为肝癌的辐射敏感基因。 方法:1 IER5基因高表达细胞系(IER5-overexpression-HepG2)的建立:设计特异性表达IER5基因的质粒,利用脂质体介导基因转染的技术,转染HepG2细胞,建立IER5基因高表达细胞模型,通过G418筛选与单克隆细胞的培养,形成了具有IER5基因高表达的单克隆HepG2细胞系,即IER5-overexpression-HepG2细胞系。同时设阴性对照(HepG2-Control),即将与人类编码基因序列无同源性的片段与载体连接转染细胞。采用Western Blotting技术检测HepG2细胞IER5蛋白质的表达,筛选有效的IER5基因过表达的单克隆细胞系(据挑选单克隆细胞时的备份号将细胞编号为HepG2-10、HepG2-11、HepG2-15、HepG2-20、HepG2-24、HepG2-21)。 2研究IER5基因高表达对HepG2细胞增殖、细胞周期和辐射效应的影响:检测0Gy、2 Gy、4 Gy辐射情况下肿瘤细胞生长曲线,以及0Gy、2 Gy、4 Gy辐射情况下细胞的周期及细胞凋亡(采用流式细胞术)。 结果:1 IER5基因高表达细胞模型(IER5-over-expression-HepG2)的建立:经Western Blotting技术检测显示:相对于HepG2-Control及其他细胞,HepG2-21单克隆细胞IER5基因蛋白表达水平明显增高,HepG2-21为有效的IER5基因过表达细胞模型,定义为IER5-over-expression-HepG2细胞系,其细胞体积比HepG2-Control细胞体积小。 2 IER5基因高表达对细胞增殖的影响:计数HepG2-Control细胞和IER5-over-expression-HepG2细胞0Gy、2 Gy、4Gy Co60γ射线照射后1-6天的细胞数,绘制细胞生长曲线。结果发现:IER5-over-expression- HepG2细胞在0Gy、2 Gy、4Gy辐射后第3或4天生长速度较对照细胞HepG2-Control开始减慢,第6天时细胞数明显少于HepG2-Control(P0.05)。 细胞接种后24小时,采流式细胞术检测未辐射的HepG2-Control细胞和IER5-over-expression-HepG2细胞在细胞周期不同阶段(G0-G1期、G2-M期、S期)的细胞百分率, IER5-over-expression-HepG2与HepG2-Control细胞处于S期的细胞百分率分别为(21.80±0.42)%和(29.36±2.08 )%,P0.05。与之相应,G0-G1期上述两种细胞百分率分别为( 46.96±2.26)%和(47.08±1.26)%,P0.05。说明IER5基因过表达,HepG2细胞的增殖能力减弱,与生长曲线结果一致。 3 IER5基因过表达对离体HepG2细胞细胞周期的影响 4Gy Co60γ射线照射后,流式细胞术测定细胞周期,结果发现:IER5-overexperssion-HepG2和HepG2-control细胞经4Gy射线照射后12小时G2-M期细胞百分率明显高于0小时(46.64±3.78)%和(18.98±2.96)%,P0.05;(51.00±4.58)%和(20.36±2.26)%,P0.05。说明照射后12小时,IER5-overexperssion-HepG2与HepG2-control细胞均出现G2-M期阻滞。 辐射后24小时HepG2-control细胞和IER5-overexperssion-HepG2细胞G2-M期细胞百分率均明显高于0小时((27.85±4.56)%vs(20.36±2.26)%, P0.05;(40.64±3.28)%vs(18.98±2.86)%,P0.05,且IER5-overexperssion- HepG2组G2-M期细胞百分率明显高于HepG2-control组(40.64±3.28)% vs(27.85±4.56)%,P0.05;此时,IER5-overexperssion-HepG2组S期细胞比例明显低于HepG2-control组(4.68±2.34)%vs8.04±1.46)%,P0.05)。说明IER5基因过表达增加了HepG2细胞发生G2-M期阻滞的细胞比率,减少了HepG2细胞进入DNA合成期S期的比率,提示IER5基因过表达削弱了HepG2细胞对辐射诱导细胞损伤的修复能力,细胞的抗辐射能力减弱,辐射敏感性增强。 4 IER5基因过表达对离体HepG2细胞细胞凋亡的影响 在2Gy、4Gy Co60γ射线照射下,辐射诱导IER5-over-expression- HepG2、IER5-SiRNA-HepG2(该细胞来源于本实验组合作成员)、HepG2-control三种细胞的细胞凋亡比例具有显著性差异(P0.05):相同辐射剂量下IER5-over-expression-HepG2比IER5-SiRNA-HepG2和HepG2-control的细胞凋亡比例明显增高,IER5-SiRNA- HepG2细胞凋亡比例最小。说明IER5基因过表达能促进HepG2细胞凋亡、削弱其抗辐射能力,而IER5基因沉默能减少HepG2细胞凋亡,增加其辐射抗性,提示IER5基因能增加HepG2细胞辐射敏感性,预示该基因可能为HepG2细胞的辐射敏感基因。 结论:1本研究成功建立了IER5基因高表达的细胞模型:IER5- ove rex perssion-HepG2细胞系,并获得国家级发明专利,专利号:200910082178.4。 2 IER5基因高表达可抑制离体HepG2细胞生长、增殖与分裂,促进细胞凋亡。 3 IER5基因过表达削弱了离体HepG2细胞对辐射诱导细胞损伤的修复能力,细胞的抗辐射能力减弱,辐射敏感性增强,预示该基因可能为肝癌的辐射敏感基因。 上述研究结论提示我们IER5基因可能为肝癌放射治疗的“有益”基因,这与我们临床上期望通过放疗增加肝癌细胞的死亡与凋亡或阻止肝癌细胞的生长与分裂的目的相一致。因此,我们预测IER5基因可能为肝癌的辐射敏感基因,此推论有待于结合临床进行更深层次的探索研究,期望为临床肝癌放疗寻找到新的增敏靶点。


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