P2Y受体介导大鼠胃体环行肌收缩反应及相关受体亚型mRNA和受体蛋白的表达

【摘要】： 核苷酸类物质对胃肠道动力和分泌功能具有重要的调节作用,其中ATP主要通过P2受体介导胃肠道平滑肌的收缩与舒张反应。有研究发现ATP诱发大鼠近端胃环行肌先舒张后收缩的双相反应。而本室研究曾报道,ATP仅使胃体环行肌产生收缩反应。我们推测,大鼠胃体环行肌的药理学特征可能不同与胃底环行肌,是分析P2受体介导胃平滑肌收缩反应的理想实验标本。P2受体包括P2X1-7和P2Y1-14多种亚型,功能复杂。目前,有关核苷酸类物质诱发大鼠胃体环行肌收缩反应的P2Y受体亚型分析、大鼠胃体平滑肌P2Y受体亚型mRNA表达的绝对定量分析及P2Y1与P2Y2受体在大鼠胃体平滑肌的表达,尚未见文献报道。本实验研究了P2受体介导大鼠胃体环行肌收缩反应的药理学特点,并应用实时荧光定量PCR技术绝对定量分析大鼠胃体平滑肌P2Y受体亚型mRNA的表达和免疫组织化学技术分析大鼠胃体平滑肌P2Y1与P2Y2受体的表达。 第一部分核苷及核苷酸类物质介导大鼠胃体环行肌收缩反应的药理学特点 制备大鼠离体胃体和胃底环行肌标本。利用受体药理学技术观察大鼠胃体和胃底环行肌不同的药理学特征,并进一步分析核苷及核苷酸类物质诱发胃体环行肌收缩反应的作用特点。 1 CCh、5-HT、His和KCl对大鼠胃体环行肌和胃底环行肌的作用 在胃体环行肌KCl所致收缩反应与胃底环行肌无显著性差别;但是,CCh收缩胃体环行肌的EC50值(0.45±0.15μmol?L-1)显著高于胃底环行肌(0.20±0.09μmol?L-1,P0.01)。5-HT和His收缩两种标本的EC50值无显著差异(P0.05);但是,在胃体环行肌5-HT和His产生收缩反应的Emax值(0.81±0.26和0.88±0.27 g)显著小于胃底环行肌(2.67±0.61和1.90±0.68 g,P0.01)。 2 ATP对预收缩大鼠胃体环行肌和胃底环行肌的作用 在预收缩胃体环行肌,ATP(0.1-3000μmol?L-1)诱发浓度依赖性收缩反应,未见舒张反应;在预收缩胃底环行肌标本,同浓度ATP诱发先舒张后收缩的双相反应,并呈浓度依赖性。 3核苷及核苷酸对大鼠胃体环行肌的作用 ATP、UTP、ADP、2-MeSATP和α,β-MeATP浓度依赖性诱发大鼠胃体环行肌收缩反应,2-MeSATP的EC50值为7.2±5.2 nmol?L-1比ACh(3.47±1.20μmol?L-1)低500倍;各药物产生收缩反应的效价序列为:2-MeSATPADPATP=UTPα,β-MeATP腺苷。 4酚妥拉明、普萘洛尔、阿托品及河豚毒素对ATP和UTP诱发大鼠胃体环行肌收缩反应的影响 酚妥拉明(1μmol?L-1)、普萘洛尔(1μmol?L-1)、阿托品(1μmol?L-1)及河豚毒素(0.1μmol?L-1)不影响ATP和UTP诱发的胃体环行肌收缩反应。 上述结果表明,大鼠胃体环行肌的药理学特征明显不同于胃底环行肌;核苷及核苷酸类物质诱发大鼠收缩反应的效价序列为2-MeSATP ADP ATP= UTPα,β-MeATP腺苷,提示通过P2Y受体介导胃体环行肌收缩反应;核苷酸类物质是调节胃体环行肌收缩功能的重要介质。 第二部分P2Y受体介导大鼠胃体环行肌收缩反应的受体药理学分析 本研究以2-MeSATP和UTP分别脱敏相应的P2Y受体,观察核苷酸类物质诱发大鼠胃体环行肌收缩反应的变化;同时分析了P2受体阻断剂苏拉明和PPADS对核苷酸类物质诱发大鼠胃体环行肌收缩反应的影响。1 UTP和2-MeSATP脱敏P2Y受体对药物诱发大鼠胃体环行肌收缩反应的影响 ATP(30μmol?L-1)、UTP(3μmol?L-1)、ADP(3μmol?L-1)、2-MeSATP(0.03μmol?L-1)、α,β-MeATP(3μmol?L-1)、ACh(3μmol?L-1)、His(30μmol?L-1)和5-HT(3μmol?L-1)诱发大鼠胃体环行肌的收缩反应在给予溶媒前后均无显著性差异(P0.05)。UTP(9μmol?L-1)脱敏时,ATP、ADP、2-MeSATP和5-HT诱发的大鼠胃体环行肌收缩反应显著增高(P0.05),其中ATP组增加了41.1%,ADP组增加了46.7%,2-MeSATP组增加了38.6%,5-HT组增加61.3%;而α,β-MeATP、ACh和His诱发的收缩反应无显著性变化(P0.05)。2-MeSATP(0.09μmol?L-1)脱敏时,ATP和ADP诱发的大鼠胃体环行肌收缩反应明显降低(P0.01),其中ATP组降低了86.7%,ADP组的收缩反应完全抑制;UTP、α,β-MeATP、ACh、His和5-HT诱发的收缩反应无显著性变化(P0.05)。 2苏拉明和PPADS对ATP、UTP和2-MeSATP诱发大鼠胃体环行肌收缩反应的影响 苏拉明(100μmol?L-1)显著抑制ATP(30μmol?L-1)、UTP(3μmol?L-1)和2-MeSATP(0.03μmol?L-1)诱发的大鼠胃体环行肌收缩反应(P0.01);其中ATP组降低了79.0%,UTP组降低了93.3%,2-MeSATP组降低了87.1%。PPADS(30μmol?L-1)使UTP(3μmol?L-1)诱发大鼠胃体环行肌的收缩反应降低61.6%(P0.01),而对ATP(30μmol?L-1)和2-MeSATP(0.03μmol?L-1)诱发的收缩反应无明显变化(P0.05)。 上述结果表明,大鼠胃体环行肌存在多种功能性P2Y受体亚型介导收缩反应;2-MeSATP、ATP和ADP可能激动环行肌细胞的同一P2Y受体亚型产生收缩反应,该收缩反应可被P2Y2和P2Y4受体脱敏所增强。P2Y2和P2Y4受体脱敏对5-HT诱发收缩反应的增强更为明显。 第三部分大鼠胃体平滑肌P2Y受体mRNA表达的定量研究 本研究应用RT-PCR技术分析了大鼠胃体平滑肌P2X受体亚型(P2X1-7)和P2Y受体亚型(P2Y1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 14)mRNA的表达;并进一步应用实时荧光定量PCR技术,绝对定量分析P2Y1, 2, 4, 6, 12, 13, 14受体mRNA在大鼠胃体组织的表达水平。 1 RT-PCR法检测P2X和P2Y受体亚型mRNA在大鼠胃体平滑肌的表达 扩增产物使用2%琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示阳性对照β-actin mRNA扩增产物显示与预期相同的特异性条带;P2X1, 2, 4, 5, 7和P2Y1, 2, 4, 6, 12, 13, 14受体mRNA扩增产物在各自相应泳道出现与扩增目的片段大小相同的特异性条带;P2X3, 6和P2Y11受体mRNA扩增产物未出现扩增目的条带。 2实时荧光定量PCR法绝对定量分析大鼠胃体平滑肌P2Y受体mRNA的表达 SYBR-green实时定量PCR检测β-actin mRNA在大鼠胃体平滑肌的表达量为9,809,756.9拷贝数/10ng总RNA,显著高于P2Y受体各亚型mRNA在大鼠胃体平滑肌的拷贝数(P0.01)。各P2Y受体亚型mRNA在大鼠胃体环行肌表达强度顺序为P2Y2 P2Y1 P2Y12 P2Y6= P2Y14 P2Y13 P2Y4 P2Y11=0。P2Y2受体和P2Y1受体mRNA在大鼠胃体平滑肌的表达量分别为75,997.5±39,709.3和21,611.5±8,294.7(拷贝数/10 ng总RNA),显著高于其他P2Y受体(P0.01)。 研究结果表明,除P2X3、P2X6和P2Y11受体亚型外,其他P2X和P2Y受体亚型的mRNA均表达于大鼠胃体平滑肌。大鼠胃体平滑肌P2Y受体亚型mRNA的绝对定量PCR分析结果表明,P2Y2受体和P2Y1受体mRNA是优势表达的P2Y受体,各受体亚型的表达强度顺序为P2Y2 P2Y1 P2Y12 P2Y6 = P2Y14 P2Y13 P2Y4。 第四部分P2Y1受体和P2Y2受体在大鼠胃体平滑肌细胞的表达 本研究应用免疫组织化学技术分析大鼠胃体平滑肌细胞(SMCs)P2Y1和P2Y2受体的表达,并对P2Y1和P2Y2受体在大鼠胃底与胃体的分布进行了比较。 阴性对照组中,大鼠胃体和胃底全层标本无特异性着色。在大鼠胃体和胃底,粘膜固有层、粘膜肌、纵行肌、环行肌和肌间神经丛可检测到P2Y1和P2Y2受体免疫反应阳性产物。腺体细胞和神经元的胞浆和平滑肌细胞的细胞核出现强阳性着色。 大鼠胃体环行肌SMCs的P2Y1受体和P2Y2受体的阳性细胞率分别为33.08%±9.93%和45.17%±6.11%,显著高于纵行肌和粘膜肌SMCs的阳性细胞率(P0.01);大鼠胃底纵行肌、环行肌和粘膜肌SMCs P2Y1受体和P2Y2受体的表达与胃体相似。在大鼠胃体和胃底的纵行肌和环行肌层,P2Y2受体的阳性细胞率显著高于P2Y1受体(P0.05);大鼠胃体粘膜肌SMCs的表达与此类似。大鼠胃体纵行肌、环行肌和粘膜肌SMCs P2Y2受体的阳性细胞率显著低于胃底同类SMCs的阳性细胞率(P0.05);胃体纵行肌和粘膜肌SMCs的P2Y1受体阳性细胞率显著低于胃底同类SMCs的阳性细胞率(P0.05),而在环行肌SMCs间无显著性差别(P0.05)。 研究结果表明,在大鼠胃体和胃底组织,P2Y1受体和P2Y2受体表达于环行肌、纵行肌和粘膜肌SMCs的细胞核;两种受体在环行肌的表达显著高于纵行肌和粘膜肌。P2Y1受体和P2Y2受体在胃体纵行肌和粘膜肌的表达显著低于胃底。此外,在大鼠胃体、胃底环行肌和纵行肌SMCs,P2Y2受体的表达显著高于P2Y1受体;胃体粘膜肌SMCs的P2Y2表达亦显著高于P2Y1。 结论 核苷酸类物质使大鼠胃体环行肌产生浓度依赖性收缩反应,是调节胃体环行肌收缩活动的重要介质;大鼠胃体环行肌的药理学特征明显不同于胃底环行肌。 大鼠胃体环行肌存在多种功能性P2Y受体亚型介导收缩反应。2-MeSATP、ATP和ADP可能作用于环行肌细胞的同一P2Y受体亚型产生收缩反应,该收缩反应可被P2Y2和P2Y4受体脱敏所增强。 P2Y受体家族中的P2Y1受体和P2Y2受体mRNA在大鼠胃体平滑肌组织呈优势表达,各受体亚型mRNA的表达强度顺序为P2Y2 P2Y1 P2Y12 P2Y6 = P2Y14 P2Y13 P2Y4。 大鼠胃体和胃底组织中P2Y1和P2Y2受体在环行肌层SMCs的表达显著高于纵行肌层,两种受体在胃体纵行肌层SMCs的表达显著低于胃底。在大鼠胃体、胃底的环行肌层和纵行肌层SMCs,P2Y2受体的表达显著高于P2Y1受体。