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四个miniSTR基因座荧光复合分型体系的构建及其法医学应用

苏珊珊  
【摘要】: 目的:miniSTR技术即在设计引物时,使其结合在更靠近核心重复序列的区域,PCR扩增的产物就会比STR基因座更短一些,可提高高度降解检材的检测成功率。大量研究证实,miniSTR检测技术对于高度降解检材是很有效的一种手段。2006年美国AB公司研制开发了minifiler试剂盒,目前已被应用到实际案件的分析中。但minifiler试剂盒仅包含8个CODIS系统(DNA联合索引系统)内的STR基因座,其系统效能不足以进行个人识别及亲缘关系鉴定。因此,为了研究更多的miniSTR基因座,并为研制国产化试剂盒做准备,本实验室自2005年以来研究了Hill等[1]报道的26个非CODIS系统miniSTR基因座在中国汉族人群的群体遗传学特征,并从中筛选出12个多态性较好的基因座用于研发复合分型试剂盒,目前已经成功构建了两组共包括8个miniSTR基因座的复合分型体系。本研究在我实验室既往成果的基础上继续构建第三组miniSTR复合分型系统,包括D6S474、D20S482、D4S2408和D6S1017四个miniSTR基因座,用分子克隆的技术制备其等位基因分型标准物,调查四个基因座在中国汉族及回族人群中的遗传多态性,并探讨其法医学应用价值。 方法:采用Chelex-100法提取135份中国汉族和114份中国回族无关健康个体全血基因组DNA。利用荧光复合扩增技术扩增D6S474、D20S482、D4S2408和D6S1017四个miniSTR基因座,ABI 310/3130基因分析仪对产物进行检测,Genemapper3.2软件分析结果。根据电泳结果对反应体系中的引物浓度、Mg2+浓度、DNA模板量、退火温度、循环次数等条件进行优化,以获得最佳反应条件。用构建的复合体系对所有样本的四个miniSTR基因座进行PCR复合扩增。 根据所有样本的群体遗传学研究结果,应用分子克隆技术制备四个基因座的等位基因分型标准物,并按照国际法医遗传学会(international society of forensic genetics, ISFG)推荐的命名原则对各等位基因进行命名。根据构建的等位基因分型标准物及测序结果对所有样本复合扩增产物进行等位基因命名,计算各基因座等位基因频率及法医学参数。 对构建的荧光标记miniSTR复合扩增体系进行灵敏度、腐败降解检材DNA检测能力的研究,并与商品化STR试剂盒进行比较。 结果:本研究成功建立了荧光标记miniSTR复合扩增体系,并用分子克隆技术制备了miniSTR基因座的等位基因分型标准物。利用该分型体系进行群体遗传学研究发现:D6S474、D20S482、D4S2408和D6S1017基因座在135份中国汉族无关个体中分别检出7、8、6、6个等位基因和14、18、14、14种基因型;在114份中国回族无关个体中分别检出6、7、5、7个等位基因和15、23、13、17种基因型。基因型频率分布经χ2检验均符合Hardy-Weinberg平衡(P0.05)。四个基因座在中国汉族人群的杂合度观察值(Ho)依次为0.748、0.711、0.748、0.659;在中国回族人群依次为0.759、0.706、0.714、0.804。在中国汉族人群的多态信息含量(PIC)依次为0.68、0.66、0.67、0.64;在中国回族人群依次为0.70、0.73、0.69、0.68。在中国汉族人群的非父排除率(PE)依次为0.507、0.446、0.507、0.368;在中国回族人群依次为0.525、0.438、0.451、0.606。在中国汉族人群的个人识别力(DP)依次为0.874、0.871、0.862、0.851;在中国回族人群依次为0.884、0.911、0.880、0.860。四个miniSTR基因座的累积非父排除率在中国汉族人群为0.914902,在中国回族人群为0.942257;累积个人识别力在中国汉族人群为0.999666,在中国回族人群为0.999827。系统灵敏度研究:本研究构建的miniSTR复合扩增系统对0.0625ng的DNA仍可进行四个基因座的正确分型。腐败降解检材研究:结果显示对降解五个月的血液检材DNA和用DNase I消化25min的DNA,应用miniSTR复合扩增系统分析在四个基因座中均得到了完整分型,显示了miniSTR技术比常规STR试剂盒对降解检材具有更高的分型成功率。 结论:本研究成功建立了四个miniSTR基因座D6S474、D20S482、D4S2408和D6S1017的荧光标记复合扩增体系并应用分子克隆技术制备了四个基因座的等位基因分型标准物。将自制的等位基因分型标准物应用于中国汉族和回族人群的群体遗传学研究,发现四个基因座具有较好的遗传多态性。本实验建立的荧光标记复合扩增体系分型结果准确,灵敏度达0.0625ng,对于分析微量、降解检材的成功率较常规STR试剂盒明显提高,可用于法医学亲权鉴定与个人识别,特别适合用于高度腐败降解检材的DNA检测,可作为常规STR试剂盒的补充,提高系统效能,同时为开发国产化miniSTR试剂盒奠定了基础。


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