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人喉癌细胞系Hep-2中的肿瘤干细胞与放疗抵抗关系的初步研究

陈坤  
【摘要】: 目的:目前研究已证实CD133是人喉癌细胞系Hep-2中肿瘤干细胞表面标志物,表达CD133+的细胞具有肿瘤干细胞的特性。本试验拟通过研究放射治疗后的人喉癌细胞系Hep-2,检测其CD133+细胞比例、细胞增殖抑制率及细胞周期分布情况,发现检测指标的变化特点及各指标之间的关系。探讨放射治疗对喉癌肿瘤干细胞的影响,验证肿瘤干细胞是否存在放疗抵抗的特性,明确肿瘤干细胞在肿瘤细胞放疗抵抗现象中的作用。为进一步研究头颈部肿瘤干细胞放疗抵抗特性及其更深层次机理做初步探索研究,为今后发现以肿瘤干细胞为靶点治疗头颈部肿瘤的新途径寻找实验方法。 方法:复苏人喉癌细胞系Hep-2细胞,在37℃、5%CO2、20%O2、饱和湿度条件下的湿润恒温培养箱中培养,取对数生长期细胞,给予不同剂量的放射治疗处理后,分别用于以下实验: 1.倒置荧光显微镜下观察Hep-2细胞接受不同剂量60Co放疗作用后细胞形态学的改变及特点。 2.应用MTT法检测人喉癌细胞系Hep-2在接受放射治疗处理后的细胞增殖抑制率,发现其放射治疗处理后的增殖生长规律。 3.应用流式细胞技术检测人喉癌细胞系Hep-2肿瘤干细胞表面标志物CD133的表达情况。比较不同检测点CD133+细胞比例的差异。筛选CD133+细胞比例最高的放疗剂量和检测时间点,为后续试验寻找最佳观测条件提供参考。 4.应用流式细胞技术检测(PI法)人喉癌细胞系Hep-2在接受20Gy的放射治疗处理后,细胞周期分布情况,发现其放射治疗处理后细胞周期的变化特点。 最后将上述试验观察的现象和检测测得的数据进行分析和比较,通过寻找各项指标间的特点和规律,探讨肿瘤干细胞与放疗抵抗现象的关系。 结果: 1.倒置荧光显微镜下定时观察,发现Hep-2细胞接受放射治疗后出现细胞形态学的变化。首先细胞由正常的多角梭形逐渐变圆,折光性增强,而后出现为细胞体积变小,胞浆内出现凋亡小体,核分裂相少见,细胞贴壁差,最后细胞漂浮崩解,呈典型细胞凋亡过程。发生凋亡的细胞数量和凋亡细胞变化的程度与放射剂量存在剂量依赖关系。 2.MTT法检测发现人喉癌细胞系Hep-2在接受放射治疗处理后,均出现细胞生长受抑制的情况。表现为细胞增殖抑制率随放射剂量增大而升高,存在剂量依赖关系;放射治疗后细胞增殖抑制率升高趋势逐渐减缓,细胞增殖受抑制现象逐渐减弱,细胞增殖能力逐渐恢复。 3.流式细胞术检测发现人喉癌细胞系Hep-2经不同剂量放射治疗后,各组均出现表达CD133+细胞比例增高的现象。表现为在一定剂量范围内(0Gy~20Gy)CD133+细胞比例与放射剂量成正相关关系(r=0.22,p0.05),超过这一范围(25Gy)CD133+细胞比例出现下降趋势;放疗后表达CD133+细胞比例表现为先升高后降低的变化规律,上升到48h最高比例点后出现下降趋势。CD133+细胞比例最高的为20Gy组放疗后48h时间点测得为2.70%±0.13%,表示20Gy和48h可作为最适宜观察条件,后续试验可以选择20Gy组和48h时间点为代表进行试验。 4.应用流式细胞术PI法检测发现,接受放射治疗后的人喉癌细胞系Hep-2细胞周期分布发生改变。人喉癌细胞系Hep-2在接受20Gy的放射治疗处理后,出现G0/G1阻滞现象,G0/G1比例最高出现在放疗后48h(68.2%±4.16%),比例变化趋势为先增加后降低。 结论: 1.经60Co放射治疗后的人喉癌细胞系Hep-2形态学变化明显,符合细胞凋亡的形态学特点; 2.经60Co放射治疗后的人喉癌细胞系Hep-2出现了CD133+细胞比例增加的现象,是Hep-2-CSC放疗抵抗的直接征象,为证明喉癌肿瘤干细胞存在放疗抵抗特性提供了依据; 3.在一定剂量范围内(0~20Gy),肿瘤干细胞比例与放射剂量存在正相关,肿瘤干细胞比例最高点为照射20Gy后48h时,可作为今后试验最适宜观察条件; 4.人喉癌细胞系Hep-2在接受放射治疗后CD133+细胞比例变化特点为先增高后降低,可能是肿瘤干细胞先由于放疗抵抗出现比率升高,而后肿瘤干细胞分化为非肿瘤干细胞又导致比例降低; 5.人喉癌细胞系Hep-2在接受放射治疗后细胞增殖能力下降后逐渐恢复,其可能的原因是肿瘤干细胞由于其放疗抵抗特性和自我更新分化能力的作用,使肿瘤细胞恢复增殖能力;尚不能确定G0/G1阻滞和比例变化是否与肿瘤干细胞有关,可后续进行肿瘤干细胞分选进一步研究。 6.以上实验结果显示,人喉癌细胞系Hep-2中存在亚群细胞有放疗抵抗特性,为肿瘤干细胞亚群,并与肿瘤增殖抑制率、细胞周期变化存在可能的联系,后续实验可深入研究其分子机制。


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