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下颌前移矫治器治疗OSAHS的动物实验研究及临床应用

卢海燕  
【摘要】: 目的:阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome, OSAHS)是临床常见的慢性睡眠障碍性疾病,多见于体重偏肥的患者。由于睡眠时下颌后缩、肌肉松弛、舌骨位置改变等原因反复发生的上气道阻塞,引起呼吸暂停和通气不足,导致白天嗜睡,并发心、脑肺、肾等多脏器损害,严重影响患者的生命和生存质量。该疾病发病率高、危害性大,近年来成为临床医学和口腔医学共同关注的边缘学科,对OSAHS的治疗引起了医患的高度重视。迄今,临床上对OSAHS的治疗方法有行为治疗,如降低体重和侧卧位睡眠等;持续气道正压通气(Continue positive airway pressure, CPAP)疗法;口腔矫治器治疗;手术治疗等。CPAP为无创性治疗,通过呼吸机持续正气压向上气道通气,打开阻塞部位。这种方法的缺点是携带不方便,由于向上气道加压,使通气患者口咽干燥不适、影响睡眠,很大一部分病人不能耐受而放弃该方法。手术治疗风险大,疗效不确定,容易复发。因此,非手术的、安全的、容易被患者接受的口腔矫治器治疗,成为医患关注的治疗方法,矫治器及其疗效的研究成为目前OSAHS非手术治疗研究的热点。 本研究通过建立OSAHS兔动物模型,观察OSAHS对外周血内皮素-1 (Endothelin-1, ET-1)、血管紧张素II (AngiotensinⅡ, AngⅡ)含量及心脏组织中ET-1 mRNA表达的影响;观察OSAHS对兔额叶皮层神经元及乙酰胆碱酯酶活性(acetylcholin-esterase, AchE)的影响;探讨OSAHS对心尖区组织及心肌内毛细血管的损伤。 通过建立OSAHS兔配戴下颌前移矫治器的动物模型,观察下颌前移矫治器(Mandibular advancement device, MAD)治疗OSAHS后,对软腭后上气道间隙、血氧饱和度、氧分压、二氧化碳分压及pH值的改变;观察MAD治疗OSAHS对外周血ET-1、AngII及心脏组织中ET-1 mRNA表达的影响;观察MAD早期治疗OSAHS兔对大脑神经元凋亡及AchE活性的影响。探讨配戴下颌前移矫治器对OSAHS兔心脏损伤的影响,为临床研究MAD治疗OSAHS对心脏和大脑的影响提供理论依据和实验室数据。 通过改进临床应用的下颌前移矫治器,研制下颌活动可调式下颌前移矫治器;通过观察OSAHS患者配戴MAD 6个月前后上气道直径变化、睡眠呼吸紊乱指数变化、血氧饱和度变化、Epworth值变化、外周血中ET-1、AngⅡ含量变化及血压、心率等变化,评价MAD治疗OSAHS的疗效,探讨下颌活动可调式MAD对OSAHS的治疗作用。 方法: 1 OSAHS动物模型建立 1.1动物分组:30只6月龄雄性新西兰兔随机分为2组:实验组,即OSAHS组和正常对照组,每组15只。 1.2模型建立前检查 1.2.1 CT检查:两组实验前仰卧位上气道CT检测实验后两组软腭后缘上1/4点、1/2点、3/4点、尖端处上气道宽度、横截面积。 1.2.2动脉血气分析:检测两组耳缘动脉血氧饱和度、氧分压、二氧化碳分压和pH值。 1.3模型建立:OSAHS组以1%戊巴比妥钠全身麻醉,于软腭中间距软硬腭交界0.5cm处,粘膜下肌层注射聚丙烯酰胺水凝胶2ml,动物出现明显打鼾和间断的呼吸暂停,停止注射。对照组不作任何处理。 1.4睡眠观察:两组动物每天以5-6ml/kg经口灌注10%水合氯醛后,仰卧位睡眠4-6小时/天,持续8周,累计记录49天睡眠期出现呼吸暂停的时间及次数。 1.5实验后检查: 1.5.1 CT检查:拍摄两组实验后仰卧位上气道CT。 1.5.2血气分析:做两组实验动物睡眠呼吸暂停时动脉血气分析。 1.5.3 HE染色:软腭HE染色检测注射凝胶的稳定性。 1.6 OSAHS动物模型鉴定标准:(1)临床出现睡眠时打鼾或呼吸暂停,呼吸暂停指数AHI5次/小时。(2)CT示上气道狭窄。(3)呼吸暂停时动脉血氧饱和度降低4%。(4)氧分压、pH值降低,二氧化碳分压升高。(5)软腭局部注射物稳定,无移位,无扩散。 1.7SPSS13.0统计软件进行统计学分析,以P0.05作为显著性检验标准。 2下颌前移矫治器治疗OSAHS兔的实验研究 动物分组:30只6月龄雄性新西兰兔随机分为3组:阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征组(OSAHS组)、OSAHS兔配戴下颌前移矫治器组(MAD组)和正常对照组,每组10只。 下颌前移矫治器模型建立:OSAHS组和MAD组共20只兔,通过软腭注射凝胶建立OSAHS动物模型后,随机选10只兔作为MAD组,取印模制作连冠式斜面导板矫治器,粘接于上前牙,下前牙咬合在斜面上导下颌向前3-4mm,前牙咬合打开2-3mm,斜面与牙长轴成30℃。 CT检查:建模后第3天,OSAHS组、MAD组和对照组动物均在全麻下做仰卧位上气道CT检查。 睡眠观察:每天上午以5-6ml/kg经口灌注10%水合氯醛,仰卧位睡眠4-6小时/天,连续8周,累计49天,记录睡眠期出现呼吸暂停的时间及次数。 血气分析:取睡眠中出现呼吸暂停时,兔耳缘动脉血做血气分析,检测血氧饱和度、氧分压、二氧化碳分压和pH值。 HE染色:软腭注射凝胶处的组织取材,进行HE染色检测其稳定性。 MAD治疗OSAHS的动物模型鉴定标准:(1)戴用MAD后2-3天能适应,能正常进食。(2)戴用MAD后仰卧位睡眠能够消除或减轻呼吸暂停。(3)戴用MAD后上气道打开,无狭窄及阻塞。(4)戴用MAD后动脉血气分析显示,血氧饱和度恢复正常。(5)模型稳定能够重复。 SPSS13.0统计软件进行统计学分析,以P0.05作为显著性检验标准。 3配戴下颌前移矫治器对OSAHS兔心脏损伤的影响 3.1动物分组、模型建立及睡眠观察:同第二部分 3.2标本留取:建模8周后,OSAHS组、MAD组和对照组动物在1%戊巴比妥钠20mg/kg全麻下,颈外静脉采血4ml,用于检测血浆中ET-1、AngⅡ含量;留取心尖区标本进行光镜及电镜观察,以及心脏组织中ET-1mRNA表达的检测。 3.3测定血浆中ET-1和AngⅡ含量:用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)检测血浆中ET-1、AngⅡ含量。 3.4 RT-PCR检测心脏组织中ET-1 mRNA的表达:一部分心尖组织放入液氮中冷冻,随后转存-80℃冰柜,进行RT-PCR检测心脏组织中ET-1mRNA的表达。 3.5心尖组织HE染色:一部分心尖组织立即放入10%福尔马林中固定,常规石蜡包埋,HE染色,AX-80多功能显微镜下,观察心肌纤维的组织学结构改变。 3.6心尖组织透射电镜观察:在同一麻醉状态下,打开动物的胸腔,暴露心脏。从距离心尖5mm处切下心尖区组织,立即取1×1×3mm3放入预冷的4%戊二醛中,常规透射电镜标本处理,Epon 812包埋,Hitach-7500透射电镜下,观察心肌纤维及纤维间毛细血管变化。 3.7 SPSS13.0统计软件进行统计学分析,以P0.05作为显著性检验标准。 4配戴下颌前移矫治器对OSAHS兔大脑损伤的影响。 4.1动物分组、模型建立及睡眠观察:同第二部分 4.2标本留取:建模8周后,以20mg/kg的1%戊巴比妥钠全麻三组动物,完整取出兔大脑。 4.3脑额叶HE染色:部分右脑额叶皮层固定于10%福尔马林24小时,常规石蜡包埋,切片厚度4μm, HE染色,AX-80万能显微镜下观察大脑神经元改变。 4.4 TUNEL染色:部分右脑额叶皮层固定于10%福尔马林中24小时后,常规石蜡包埋、切片厚度4μm, TUNEL染色,观察额叶神经元凋亡情况。 4.5流式细胞分析:部分右脑额叶皮层固定于预冷的70%乙醇中24小时,制备成单细胞悬液,进行流式细胞分析,检测细胞凋亡率。 4.6比色法检测乙酰胆碱酯酶活性:左脑额叶皮层称重,置于相当于组织重量9倍的匀浆介质中,将额叶皮层制备成匀浆液,4℃下3000转/分离心15min,取上清,-80℃保存。Bardford法测样品蛋白含量,比色法检测样品反应后各管吸光度,利用公式计算额叶皮层中AchE活性。 4.7应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,以P0.05作为显著性检验标准。 5可调式下颌前移矫治器治疗OSAHS的临床研究 5.1患者基本资料:由河北医科大学口腔医院阻塞性睡眠呼吸障碍中心选择OSAHS患者20例,男性19人,女性1人,年龄32-72岁,平均体重83.72±13(68-95)kg,肥胖指数(BMI)28.97±2.35kg/m2,平均颈围41.92±2.12cm。 5.2治疗前检查 5.2.1多导睡眠监测(Polysomnograph,PSG):治疗前做PSG,确定为阻塞性睡眠呼吸紊乱。 5.2.2 X线头颅侧位片:拍摄治疗前X线头颅侧位片,定点、测量上气道大小及舌骨位置。 5.2.3 Epworth测量表评估。 5.2.4测量晨起血压。 5.2.5放射免疫法测定治疗前血浆中ET-1.AngII含量。 5.3制戴矫治器:患者在知情情况下,同意咬取印模,咬蜡牙合记录。拍摄蜡牙合记录时的头颅侧位片确定上气道是否打开,制戴下颌可活动式MAD。戴用后下颌前伸量为最大前伸量的75%,前牙垂直向打开1-2mm,一般3-7天适应。 5.4复诊检查:制戴矫治器后6个月,再次做多导睡眠呼吸监测;Epworth测量表评估;测量晨起血压;放射免疫法测定血浆中ET-1.AngII含量。 5.5应用SPSS13.0统计软件进行配对t检验,以P0.05作为显著性检验标准。 结果: 1 OSAHS动物模型建立 1.1上气道CT结果 实验前OSAHS组软腭1/4点、1/2点、3/4点及最下点处上气道矢状向间隙分别为:4.14±0.74mm.3.86±0.58mm.3.89±0.72mm.4.86±1.20mm;横截面积分别为:22.60±3.91 mm2、20.20±2.59 mm2、20.40±3.05 mm2、30.00±3.94 mm2,和正常对照组相比,P0.05,无统计学差异。实验后OSAHS组仰卧位上气道软腭1/4、1/2、3/4点、最下点处矢状向直径分别为3.38±0.75mm.2.59±0.69mm.2.92±0.70mm:横断面积分别为17.50±1.0mm2、13.33±1.97 mm2、14.00±2.74 mm2,均较对照组减小,P0.05,有统计学意义。 1.2血气分析 实验前OSAHS组血氧饱和度(SaO2)、氧分压(PO2)、二氧化碳分压(Pco2)、pH值分别为:96.58±1.97%、90.10±17.26mmHg.37.10±5.20 mmHg.7.43±0.14,与正常对照组相比无差异,P0.05。实验后OSAHS组睡眠呼吸暂停时的SaO2、Po2、pH值分别为77.94±13.83%、51.20±13.23mmHg、7.31±0.11低于对照组,有统计学意义,P0.05;Pco2为51.55±13.64 mmHg高于对照组,P0.05,有统计学意义。 1.3睡眠观察 OSAHS组出现打鼾和间断的呼吸暂停;连续8周,累计49天的观察记录:呼吸紊乱指数为16±4次/小时,呼吸暂停最长时间为27秒。呼吸暂停时发现耳缘动脉颜色变暗,唇粘膜发绀,时常因憋气而觉醒。在注射后10天左右出现嗜睡症状。 1.4OSAHS组注射后8周,软腭组织切片光镜观察发现,注射凝胶周围被纤维结缔组织完整包裹,没有扩散。 2下颌前移矫治器对OSAHS兔治疗作用的实验研究 2.1 CT上气道矢状向间隙变化的测量结果 MAD组软腭1/4点、1/2点和3/4点上气道矢状向间隙分别为3.67±0.45mm.2.71±0.44mm和2.77±0.43mm,与0SAHS组相比软腭后气道间隙增加,有统计学意义,P0.05;和正常对照组比减小,但没有统计学意义,P0.05。 2.2 CT上气道横截面积变化的测量结果 MAD组的软腭1/4点、1/2点和3/4点处上气道横截面积分别为22.45±2.13 mm2、18.97±1.65 mm2、20.27±3.41 mm2,和0SAHS组相比软腭后上气道横截面积增加,有统计学意义,尸0.05.MAD组较对照组上气道横截面积均减小,但无统计学意义,P0.05。 2.3动脉血气分析的测定结果 MAD组SaO2(%)、Po2、Pco2、pH分别为92.40±3.13%、91.20±3.15mmHg.39.26±2.93mmHg.7.41±0.07,和OSAHS相比SaO2(%)、P02和pH值增加,PcO2降低,P0.05,均有统计学意义;MAD组和正常对照组相比各项指标,P0.05,均无统计学意义。 2.4实验动物的一般情况 OSAHS组及MAD组动物1-2天适应后无进食、进水困难,注射伤口愈合良好无感染,仰卧位睡眠时,MAD组4只呼吸均匀平稳无打鼾,6只轻微打鼾,未见呼吸暂停;对照组呼吸均匀平稳,无打鼾和呼吸暂停;OSAHS组有打鼾和呼吸暂停。 2.5 MAD组戴矫治器8周后,软腭组织切片光镜观察发现,注射凝胶周围被纤维结缔组织完整包裹,没有引起组织损伤、炎症或坏死。 3下颌前移矫治器对OSAHS兔心脏损伤的影响 3.1血浆中ET-1.AngII含量测定 3.1.1 ET-1在三组分别为OSAHS(7.93±1.18 pk/ml);MAD(2.80±1.41 pk/ml);对照组(2.11±0.80 pk/ml). 3.1.2 AngⅡ在三组分别为OSAHS(13.18±3.64 pk/ml);MAD(8.80±1.70 pk/ml);对照组(7.19±1.92pk/ml). 两项指标中,OSAHS与MAD、对照组相比均有增加,P0.05;而MAD与对照组无差别,P0.05。 3.2血浆中ET-1.AngII与血气分析的相关分析结果 ET-1与SaO2、Po2呈负相关,相关系数分别为-0.64、-0.52,P0.05;与Pco2呈正相关,相关系数为0.53,P0.05。 AngII与SaO2、Po2呈负相关,相关系数分别为-0.66、-0.53,P0.05;与Pco2呈正相关,相关系数为0.61,P0.05。 3.3 RT-PCR结果显示: 正常对照组ET-1/GAPDH之比为1.78±0.75;MAD组ET-1/GAPDH之比为1.98±0.59;OSAHS组ET-1/GAPDH之比为2.47±0.58。OSAHS组较正常对照组及MAD组心肌细胞ET-1 mRNA表达明显升高,P0.05;正常对照组与MAD组比较无差异,P0.05。 3.4心肌纤维的改变 3.4.1肉眼观察:三组动物心尖外形无明显改变。 3.4.2光镜观察 OSAHS组中大量心肌纤维断裂、消失、形成裂隙,纤维排列紊乱。心肌组织出现液化,形成空泡,心肌结构严重破坏,未见清晰闰盘结构。MAD组中少量心肌纤维排列紊乱,结构疏松,偶有纤维断裂,见清晰闰盘结构。对照组中心肌纤维完整,排列整齐,闰盘清晰可见。 3.4.3电镜观察 OSAHS组肌原纤维排列紊乱,结构模糊,大量肌原纤维溶解、破坏消失,形成许多大小的间隙,肌节不完整。线粒体大部分嵴和膜有融合和消失现象,有的线粒体有致密化。MAD组肌原纤维排列稍紊乱,有少量心肌纤维断裂消失,部分肌节结构不清,线粒体部分嵴和膜有融合和消失现象。对照组肌原纤维排列整齐,横纹清晰可见,闰盘结构清晰。 3.5心肌纤维间毛细血管的改变 电镜观察发现:OSAHS组毛细血管管腔无明显扩张或狭窄。内皮细胞表面有微绒毛突起,内皮细胞胞质内局部有肿胀,线粒体的嵴和膜有融合和消失现象,核周间隙增宽,核染色质固缩,有核膜下边集现象。毛细血管基底膜增厚。 MAD组内皮细胞胞质内可见吞饮小泡,细胞间可见紧密连接,线粒体的嵴和膜有部分融合和消失现象,有的线粒体出现致密化和髓样化改变,核染色质有固缩和核膜下边集。基底膜稍增厚。 对照组内皮细胞胞质内可见吞饮小泡,微丝,线粒体和粗面内质网。内皮细胞间有紧密连接,基底膜完整。 4配戴下颌前移矫治器对OSAHS兔大脑损伤的影响 4.1 HE染色显示,OSAHS组额叶皮层可见神经元胞体缩小,核固缩、深染。MAD组和对照组额叶皮层神经元未发现或偶见核固缩。 4.2 TUNEL染色显示,OSAHS组额叶皮层可见核染色呈棕黄色凋亡神经元。MAD组和对照组未发现或偶见凋亡。 4.3流式细胞仪检测发现,OSAHS组凋亡率为7.40±1.26%,较MAD组(2.26±0.38%)和对照组(1.94±0.24%)明显升高,有统计学意义,P0.05。 4.4 AchE活性:OSAHS组为0.08±0.15U/mgprot,较MAD组(0.12±0.13 U/mgprot)和对照组(0.13±0.13U/mgprot)明显降低,有统计学意义,P0.05。 4.5大脑额叶神经元凋亡率与血氧饱和度相关系数为-0.78,有统计学意义,P0.05、乙酰胆碱酯酶活性与血氧饱和度的相关系数为0.639,有统计学意义,P0.05。 5可调式下颌前移矫治器治疗OSAHS的临床研究 5.1多导睡眠监测结果 5.1.1治疗后AI、AHI、RAI、低氧指数较治疗前显著减小,P0.05;呼吸暂停平均时间及最长时间均较治疗前有显著减少,P0.05。 5.1.2平均呼吸紊乱指数降低百分数△AHI(%)为43.69±14.56%,根据疗效鉴定标准为有效;20例中AAHI(%)25%的有一例为无效;△AHI(%)50%的有9例为显效;其余10例△AHI(%)在25%-50%均为有效。 5.1.3平均SaO2治疗前为81.92±3.93%、治疗后为90.33±2.50%;最低SaO2治疗前为71.20±11.46%、治疗后为80.34±12.19%,均显著增加,P0.05。低氧指数由46.82±13.21降低为29.50±9.87,P0.05。 5.1.4睡眠效率治疗前为82.78±13.21%,治疗后为92.45±17.21%,P0.05。NREM治疗前占73.24±11.91%,治疗后占78.95±17.2%,P0.05。REM治疗前占27.03±3.23%,治疗后占21.04±2.10%,P0.05。 5.2 X线头颅侧位片 戴用MAD后上气道软腭后间隙及舌根后气道间隙均有显著增加,P0.05;鼻咽直径、硬腭后气道间隙及喉咽间隙未见改变,P0.05;舌骨到MP平面距离减小,P0.05;舌骨到颈椎前平面距离增加,P0.05。 5.3Epworth测量表比较 20例治疗前平均16±5分,最低为9分,最高为23分。20例治疗满半年后7±4分,最低为4分,最高为16分,P0.05。 5.4 ET-1、Angll测量结果 ET-1矫治前为63.90±11.07pk/ml,矫治后为57.76±9.36pk/ml,矫治半年后明显降低,P0.05。Angll治疗前为94.26±16.38pk/ml,治疗后为85.29±13.52pk/ml,矫治半年后明显降低,P0.05。 5.5 ET-1与呼吸紊乱指数成正相关,相关系数为0.58,P0.05,与平均血氧饱和度成负相关,相关系数为-0.69,P0.05。Angll与呼吸紊乱指数呈正相关,相关系数为0.60,P0.05,与平均血氧饱和度成负相关,相关系数为-0.74,P0.05。 5.6早晨收缩压治疗前为135.25±15.98mmHg;治疗后为120±8.95mmHg, P0.05。 5.7心率改变情况 治疗前睡眠期间最快心率为121±12次/分,治疗后为98±9次/分,P0.05;治疗前睡眠期间最低心率为40±15次/分,治疗后为50±10次/分,P0.05;治疗前睡眠期间平均心率为72.44±6.8次/分,治疗后为66.23±7.32次/分,P0.05;治疗前清醒期间平均心率为78.47±9.60次/分,治疗后为71.29±8.67次/分,P0.05。 结论: 1成功建立OSAHS兔动物模型; 2 OSAHS可以引起心肌纤维和心肌纤维间毛细血管内皮的损伤; 3 OSAHS可以增加额叶皮层神经元的凋亡,降低乙酰胆碱酯酶活性; 4成功建立OSAHS兔配戴下颌前移矫治器动物模型; 5下颌前移矫治器能有效治疗OSAHS兔; 6下颌前移矫治器早期治疗OSAHS兔可以预防心肌纤维和心肌纤维中毛细血管内皮的损伤; 7下颌前移矫治器治疗OSAHS兔可减少额叶皮层神经元的凋亡、预防乙酰胆碱酯酶活性降低; 8临床下颌活动可调式MAD治疗OSAHS患者,可以打开口咽部上气道间隙,舌骨前上移位,AHI提高43.69±14.56%,达到有效治疗目的; 9临床下颌活动可调式MAD治疗OSAHS患者,可以改善睡眠状态,提高睡眠效率; 10临床下颌活动可调式MAD治疗OSAHS患者,可以降低外周血中ET-1、AngⅡ的含量,预防OSAHS对心脏及血管内皮细胞的损伤。


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