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依达拉奉对小鼠蛛网膜下腔出血早期ERK1/2调控海马神经元凋亡及VEGF介导脑动脉内皮细胞凋亡的影响

王凯杰  
【摘要】: 第一部分小鼠蛛网膜下腔出血模型制备及评价 目的:制作小鼠血管内插线致蛛网膜下腔出血模型,并对该模型的死亡率、神经学改变及蛛网膜下腔出血的程度进行评价。 方法: 1实验动物及分组体重28g-32g雄性昆明小鼠30只,随机分为假手术组6只、模型组24只。 2模型制备采用血管内插线法建立小鼠蛛网膜下腔出血模型。手术显微镜下行颈部正中切口,依次分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。颈外动脉结扎并剪断,与颈内动脉拉成直线,将头端打磨的5-0单丝尼龙线从颈外动脉送入颈内动脉,直至大脑前动脉与大脑中动脉分叉处,遇到阻力后再将尼龙线向前送入3mm以穿破分叉部,然后迅速退出尼龙线。假手术组尼龙线只感到阻力但不穿破血管。 3检测指标及方法麻醉醒后开始观察小鼠的一般状况和神经功能缺失情况;24h进行神经功能评分,观察两组死亡率;处死小鼠判定蛛网膜下腔出血严重程度并对出血等级进行判定。 结果: 1一般状态观察假手术组小鼠精神状态好,模型组小鼠精神萎靡,进食量减少,出现全身抖动、动作减少甚至不动。 2神经功能缺失体征的观察模型组小鼠表现为自主活动减少或消失,攀爬差或不能,提起鼠尾时前肢伸展差或不能,躯干及触须反应减弱或消失。假手术组小鼠无上述表现。24小时神经学评分假手术组(21.0±0.0),模型组(14.8±1.5),两组相比有统计学差异(P0.05)。 3大体观察模型组小鼠可见大脑半球肿胀,以手术侧为重;蛛网膜下腔弥漫出血,以大脑中动脉与大脑前动脉分叉部为多。假手术组无出血。 4出血评分结果出血2级者4只,3级者8只,4级者12只。 5死亡率24小时假手术组无死亡,模型组死亡9只,死亡率为37.5%。 结论:模型组小鼠术后出现不同程度的神经缺失症状;大体可见蛛网膜下腔出血,出血部位多集中在大脑前动脉及大脑中动脉分叉部,近似临床。适合模拟人类动脉瘤性蛛网膜下腔出血的研究,造模成功。 第二部分小鼠蛛网膜下腔出血早期ERK1/2、Bax、caspase-3调控海马神经元凋亡及依达拉奉的治疗作用 目的:探讨ERK1/2在蛛网膜下腔出血早期脑损伤中的作用,分析p-ERK1/2与海马神经元凋亡的关系及其凋亡的级联启动机制,以及依达拉奉对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤是否有治疗作用及其可能的机制。 方法: 1实验动物及分组体重28g-32g雄性昆明小鼠随机分为假手术组、模型组、依达拉奉组。 2模型及给药方法采用血管内插线法建立小鼠蛛网膜下腔出血12h、24h、48h、72h模型。假手术组仅插线但不刺破血管。依达拉奉(3mg/kg体重)术后30min起腹腔注射,每12h注射一次,用药至处死的各时相点。模型组,在相同时相仅注射等量的NS。 3检测指标及方法在预定时间点进行蛛网膜下腔出血评分;神经功能损害评分;HE染色观察光镜下组织学变化;免疫组织化学方法检测海马p-ERK1/2、Bax、caspase-3的表达及分布情况;Western blot法检测海马p-ERK1/2、Bax、caspase-3蛋白表达量的情况;TUNEL法检测海马细胞凋亡的变化规律。 4定量测定及统计方法蛋白定量将NC膜用扫描仪进行扫描,经自动图像分析系统测定条带平均光密度值进行半定量分析。实验中所得数据均用x±s表示,用SPSS 13.0 for windows统计软件进行秩和检验、t检验和单因素方差分析,Pearson方法相关分析,以单侧P0.05表示差异有统计学意义。 结果: 1各组间蛛网膜下腔出血评分假手术组无出血;模型组与依达拉奉组组间出血等级统计学无差异(P0.05)。 2神经功能学评价依达拉奉组各时间点神经学评分明显好于模型组小鼠(P0.05)。 3形态观察结果HE染色观察假手术组海马神经元数量多,排列整齐,形态完整。模型组海马神经元肿胀,细胞周围间隙增宽,出现核固缩。依达拉奉组细胞结构相对完整,损伤程度较轻。 4 p-ERK1/2免疫组化及Western blot检测结果免疫组化:假手术组偶见p-ERK1/2阳性细胞,微量表达于胞浆;模型组与假手术组比较,24h在胞浆大量表达并部分表达于细胞核内;依达拉奉组p-ERK1/2免疫阳性反应性时程与模型组相似,大部分表达于胞浆,但表达量减少。Western blot:假手术组仅有微量表达,在各时间点无变化;模型组在12h表达增加,24h达峰;依达拉奉组各时间点表达与模型组相似,但表达量均降低,以12h(2.04±0.04,2.91±0.11)、24h(2.62±0.14,3.97±0.07)降低明显,有统计学差异(P0.05)。 5 Bax免疫组化及Western blot检测结果免疫组化:假手术组偶见Bax免疫阳性细胞,微量表达于胞浆;模型组与假手术组比较,24h大量表达于胞浆;依达拉奉组时程与模型组相似,但表达量降低。Western blot:假手术组仅有微量表达,各时间点无变化;与假手术组比较,模型组在出血后12h明显增加,24h达峰;依达拉奉组各时相点与模型组比较表达均有不同程度降低,以12h(1.06±0.04,2.35±0.04)、24h(2.03±0.06,3.97±0.02)下降明显,有统计学意义( P0.05)。 6 caspase-3免疫组化及Western blot检测结果免疫组化:假手术组偶见免疫阳性表达于胞浆;模型组与假手术组比较,出血后24h可见caspase-3阳性表达于胞浆,48h明显增加;依达拉奉组时程与模型组相似,但表达减少。Western blot:假手术组仅有微量表达,各时间点无变化;模型组在出血后24h明显增加(2.89±0.08),48h达峰(3.97±0.07),依达拉奉组各时相点与模型组比较,caspase-3表达均有不同程度降低,以48h(2.03±0.04,3.97±0.07)、72 h(1.50±0.02,2.09±0.01)有统计学差异(P0.05)。 7细胞凋亡检测结果假手术组偶见TUNEL阳性细胞;与假手术组比较,模型组24h TUNEL阳性细胞开始增加,随时间推移逐渐增多,72h达高峰;依达拉奉组与模型组比较各时相点TUNEL阳性细胞明显减少,但以24h(0.176±0.002,0.261±0.002)、48h(0.241±0.002,0.336±0.010)、72h(0.270±0.005,0.483±0.009)有统计学差异(P0.05)。 8相关分析结果SAH后12h至48h,p-ERK1/2表达量与Bax呈正相关(r=0.676,P0.05);12h至72h,Bax表达量与casepase-3呈正相关(r=0.612,P0.05);12h至72h,casepase-3表达量与TUNEL阳性细胞数呈正相关(r=0.659,P0.05)。 结论: ERK1/2信号通路通过Bax、caspase介导蛛网膜下腔出血后早期海马神经元凋亡;依达拉奉通过抑制p-ERK1/2的激活,减轻蛛网膜下腔出血早期神经元凋亡,改善神经功能。 第三部分小鼠蛛网膜下腔出血早期血管痉挛与VEGF介导的脑动脉内皮细胞凋亡的关系及依达拉奉的治疗作用 目的:探讨VEGF与蛛网膜下腔出血早期血管内皮细胞凋亡的关系以及VEGF在脑血管痉挛发生中的作用,以及依达拉奉对蛛网膜下腔出血早期血管痉挛是否有治疗作用及其可能的机制。 方法: 1实验动物及分组体重28g-32g雄性昆明小鼠随机分为假手术组、模型组、依达拉奉组。 2模型及给药方法采用血管内插线法建立小鼠蛛网膜下腔出血12h、24h、48h、72h模型。假手术组仅插线但不刺破血管。依达拉奉(3mg/kg体重)术后30min起腹腔注射,每12h注射一次,用药至处死的各时相点。模型组,在相同时相仅注射等量的NS。 3检测指标及方法在预定时间点进行蛛网膜下腔出血评分;神经功能损害评分;HE染色观察光镜下组织学变化;原位杂交法检测大脑中动脉VEGF mRNA的表达及分布情况;Western blot法检测大脑中动脉VEGF蛋白表达量的情况;TUNEL法检测大脑中动脉内皮细胞凋亡的变化规律。 4定量测定及统计方法蛋白定量将NC膜用扫描仪进行扫描,经自动图像分析系统测定条带平均光密度值进行半定量分析。实验中所得数据均用x±s表示,用SPSS 13.0 for windows统计软件进行秩和检验、t检验和单因素方差分析,Pearson方法相关分析,以单侧P0.05表示差异有统计学意义。 结果: 1各组间蛛网膜下腔出血评分假手术组无出血;模型组与依达拉奉组组间出血等级统计学无差异(P0.05)。 2神经学评价24h、48h、72h依达拉奉组神经学评分好于模型组小鼠(P0.05)。 3大脑中动脉形态改变及直径测量结果假手术组光镜下可见大脑中动脉管腔光滑,内皮细胞排列平整,平均大脑中动脉直径110.67±7.57μm;模型组24h动脉出现痉挛,表现为管腔变窄、血管壁显著增厚、内弹性膜呈折扇样弯曲,72h痉挛程度最重,大脑中动脉直径53.33±2.52μm,缩窄54.24%;依达拉奉组相应时间光镜观察大脑中动脉痉挛程度均减轻,内弹性膜基本平整,血管壁增厚及管腔狭窄程度明显改善,动脉直径加粗,72h大脑中动脉管径直径88.00±2.65μm,与模型组比较差异有统计学意义(P0.05)。 4大脑中动脉VEGF mRNA原位杂交及VEGF Western blot检测结果原位杂交:假手术组VEGF mRNA表达未见异常;模型组VEGF mRNA阳性信号在内皮细胞及外膜显著表达;依达拉奉组各时间点表达与模型组相似,但表达量均有不同程度降低,与模型组相比,以24h(1.987±0.004,2.275±0.001)、48h明显降低(1.764±0.001,2.271±0.003),有统计学意义(P0.05)。Western blot:假手术组仅有微量表达,在各时间点无变化;模型组出血后12h开始增加,24h达峰,后逐渐降低;依达拉奉组各时相点VEGF表达显著降低,与模型组相比,以24h(1.73±0.02,2.57±0.04)、48h(1.57±0.01,2.50±0.02)明显降低,有统计学意义(P0.05)。 5大脑中动脉内皮细胞凋亡检测结果假手术组偶见TUNEL阳性细胞;模型组与假手术组比较,伤后24h TUNEL阳性细胞开始增加,随时间推移逐渐增多,伤后72h达高峰;与模型组比较,依达拉奉组各时间点TUNEL阳性表达明显减弱,以24h(0.232±0.019, 0.342±0.010)、48h(0.262±0.002, 0.422±0.003)、72h (0.372±0.018, 0.555±0.035)明显减少,P0.05。 6相关分析结果SAH后12h至72h,VEGF mRNA与VEGF表达量呈正相关(r=0.751,P0.05);VEGF表达量与血管TUNEL阳性细胞数呈正相关(r=0.659,P0.05) ; TUNEL阳性细胞数与血管痉挛呈正相关(r=0.631,P0.05)。 结论:蛛网膜下腔出血后血管壁内皮凋亡可能是脑血管发生痉挛的原因之一,而脑动脉内皮细胞凋亡与VEGF表达增高有关。依达拉奉通过抑制VEGF表达,可以减轻蛛网膜下腔出血早期脑动脉内皮细胞凋亡,缓解脑血管痉挛,改善神经功能。


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