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羟基红花黄色素A对体外培养子宫内膜异位症在位内膜细胞增殖及细胞因子表达的影响

翟爱丽  
【摘要】: 目的:以不同浓度羟基红花黄色素A(HSYA)干预体外培养子宫内膜异位症(Endometriosis, EMs)在位子宫内膜细胞。四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测HSYA对在位子宫内膜细胞的生长增殖的影响,酶联免疫吸附法(ELISA)测定HSYA对细胞培养上清液中细胞因子VEGF、bFGF分泌的影响。从而探讨HSYA治疗子宫内膜异位症的可行性。 方法: 1研究对象 1.1实验组:选2009年10月—2010年1月在我院行腹腔镜或开腹手术治疗的EMs患者(术后病理证实均为增殖期),共15例(38.13±7.26岁)。 1.2对照组:选择同期在我院因、纵隔子宫、畸胎瘤、单纯囊肿经腹腔镜检查无盆腔子宫内膜异位症(术后病理证实正常子宫内膜增殖期)者,共14例(34.92±8.11岁)。 两组患者月经周期正常,近6个月无服用激素类药物及免疫抑制类药物史及IUD置入史。排除:子宫内膜息肉、急慢性盆腔炎、乳腺癌、子宫内膜癌等其它妇科恶性肿瘤;内分泌、免疫及代谢性疾病;高血压、心脏病、肾病等内科疾病等。采取标本均得到患者的同意,并签署了知情同意书。 2标本采集 刮取子宫内膜,立即置于冰浴的含青霉素和链霉素的1:1DMEM/F12培养基中,2小时内送实验室进行培养。 3实验方法 3.1细胞培养 子宫内膜组织经漂洗、分离、消化、过滤。台盼兰染色,鉴定细胞活力。接种于含10%NBCS、青霉素及链霉素的FD的细胞培养瓶中,孵育24h换液,弃去未贴壁细胞及红细胞,继续培养,每隔48h换液一次,倒置显微镜下观察细胞形态变化及生长状况。 细胞长满80%瓶壁时,胰蛋白酶消化后,传代培养。细胞波形蛋白抗体及角蛋白抗体进行免疫化学细胞鉴定。 3.2细胞生长测定 3.2.1正常生长曲线 取第2-3代细胞接种于96孔培养板,并设凋零孔。培养24、48、72、96、120、144小时后,每孔加入MTT、二甲基亚砜(DMSO),酶联免疫检测仪测定细胞吸光度值(OD值),绘制细胞生长曲线。 3.2.2药物干预后细胞生长曲线 取第2-3代细胞接种于96孔培养板,24h贴壁后加入不同浓度的GnRHa和HSYA ,每一浓度设5个复孔,并设空白组。培养24、48、72h后加MTT、DMSO,测定OD值,绘制细胞生长曲线。 3.3 ELISA法测定细胞因子 取第2-3代细胞接种于24孔培养板,含10%NBCS的FD培养24h,换含2%NBCS的FD继续培养24h,弃上清液,分别加入含不同浓度的GnRHa和HSYA的FD培养基,设立空白对照组,每组设3个复孔,48h后收集细胞培养上清液,于-20℃冻存待测, ELISA法测定VEGF及bFGF的含量。 结果: 1细胞生长情况 EMs在位内膜细胞培养成功率为93.3%,正常子宫内膜细胞培养成功率为92.9%,细胞活力均在90%以上。 2细胞鉴定 ①基质细胞Vimentin染色阳性,细胞胞浆呈棕黄色。②腺上皮细胞Cytokeratin染色阳性,细胞胞浆呈棕黄色。③阴性对照:PBS作为一抗,Vimentin及Cytokeratin染色均阴性。 倒置显微镜下观察,子宫内膜细胞接种0.5h后即开始贴壁,24h后基本贴壁完全并开始生长。约2-4天细胞生长加快,以后生长减慢开始进入平台期。细胞紧密连接,排列较规则。 3药物对离体细胞生长的影响 3.1 HSYA对离体细胞生长的抑制作用 药物作用24h后,细胞生长受到抑制,但无显著差异。 药物作用48h、72h后,HSYA显著抑制细胞生长,呈剂量依赖性即HSYA浓度越大OD值越小(与细胞数成正比)。 随着HSYA作用时间的延长及药物浓度的增加,对细胞的抑制作用逐渐增强。 3.2 GnRHa对离体细胞生长的抑制作用 药物作用24h后,细胞生长受到抑制,但无显著差异。 药物作用48h、72h后,细胞生长受到显著抑制,呈剂量依赖性。随着GnRHa作用时间的延长及药物浓度的增加,对细胞的抑制作用逐渐增强。 3.3 HSYA和GnRHa对离体细胞生长的抑制作用的比较 药物作用24h后,两种药物对细胞有抑制作用但无明显差异。 48h后HSYA 20、2、0.2μg/ml组分别与GnRHa10、1、0.1μg/ml组同级比较,GnRHa对细胞的抑制作用强于HSYA。HSYA 20μg/ml组比GnRHa 1μg/ml组抑制作用强,HSYA 2μg/ml组比GnRHa 0.1μg/ml组对细胞的抑制作用强。 72h后HSYA 20、2、0.2μg/ml组分别与GnRHa10、1、0.1μg/ml组同级比较,GnRHa对细胞的抑制作用强于HSYA。HSYA 20μg/ml组与GnRHa 0.1μg/ml组抑制作用强。HSYA 2μg/ml组比GnRHa 0.01μg/ml组对细胞的抑制作用有统计学意义。 4两种药物作用于正常子宫内膜细胞虽然有一定的抑制作用,但并没有统计学意义。 5药物对细胞培养上清液中细胞因子表达的影响 5.1 HSYA和GnRHa对细胞培养上清液中VEGF表达的抑制作用与不加药对照组比较,HSYA和GnRHa各浓度组均显著抑制VEGF的表达,呈剂量依赖性。 两种药物抑制作用的比较,HSYA 20、0.2μg/ml组分别比GnRHa 0.1、0.01μg/ml组抑制作用强。因此虽然GnRHa对VEGF的抑制作用比HSYA强,但在一定范围内HSYA比GnRHa作用强。 5.2 HSYA和GnRHa对细胞培养上清液中bFGF表达的抑制作用与不加药组比较,HSYA20、2μg/ml组和GnRHa10、1μg/ml组均显著抑制bFGF的表达,呈剂量依赖性。 两种药物抑制作用的比较,HSYA 20、2μg/ml组对bFGF表达的抑制作用比GnRHa组10、1μg/ml组对bFGF强有统计学意义。由此可见,HSYA对bFGF的抑制作用比GnRHa强。 结论: 1子宫内膜细胞体外培养模型成功建立。 2子宫内膜细胞分为间质细胞及腺上皮细胞两种。基质细胞中波形蛋白染色阳性,腺上皮细胞中角蛋白染色阳性。细胞悬液中基质细胞为单个细胞,圆形。腺上皮细胞为细胞团,类似葡萄串状。 3细胞接种后约0.5小时开始贴壁,大约24小时细胞贴壁完成。2-4天细胞生长加快,第5天以后细胞生长进入平台期。 4 HSYA及GnRHa均能显著抑制体外培养的EMs在位子宫内膜细胞的增殖,呈剂量-时间依赖性。同级比较GnRHa比HSYA抑制作用强,但在一定的浓度范围内HSYA比GnRHa对细胞的抑制作用强。 5 HSYA及GnRHa对EMs在位内膜细胞体外培养上清液中细胞因子VEGF及bFGF的表达均具有抑制作用,呈剂量依赖性。GnRHa对VEGF的抑制作用强于HSYA,HSYA对bFGF的抑制作用强于GnRHa。 6两种药物作用于正常子宫内膜细胞虽然有一定的抑制作用,但并没有统计学意义。 HSYA对EMs离体在位子宫内膜细胞增殖的抑制作用可能是通过其对VEGF及bFGF表达的下调实现的。提示HSYA可能是治疗EMs的潜在药物,为子宫内膜异位症的治疗提供新的理论基础。


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