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波动性高糖对大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

冯朝彩  
【摘要】: 目的:大血管并发症是糖尿病(diabetes melletus, DM)患者致死的首要原因,动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)与DM关系密切。DM患者血糖控制不理想与微血管和大血管病变紧密相关,高血糖在DM血管并发症的发展过程中起着主要作用。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的过量增生是AS的一个主要特征。已证实,细胞增生是内膜增厚的基本特征之一,但现在普遍认为细胞凋亡调节的紊乱也同样重要。许多研究证实,高浓度葡萄糖可促进AS的发展,增加体外VSMCs的生长率。高糖不仅能显著抑制无血清诱导的体外培养大鼠VSMCs的凋亡,还能增强抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达,此外明显降低人冠状动脉平滑肌细胞的DNA断裂率。AS中VSMCs的大量聚集是细胞高度增生和凋亡减少共同作用的结果。高血糖对糖尿病患者的病理作用可能主要有两种形式,慢性波动性高血糖与慢性持续性高血糖。慢性波动性高血糖是指慢性间歇性或阵发性高血糖状态,也称血糖漂移(intermittent glucose)。而最近的研究发现前者更能促进糖尿病患者大血管并发症的发生与发展。相同HbA1c患者由于血糖波动幅度不同,其并发症风险存在巨大差异,也就是波动性高血糖加速动脉粥样硬化的进展。 体外研究发现,持续性高浓度葡萄糖以浓度依赖形式诱导血管内皮细胞凋亡,而波动性高葡萄糖比持续性高葡萄糖更能增加血管内皮细胞凋亡率。所以波动性高葡萄糖对血管内皮细胞的功能损伤较持续性高血糖更严重。提示波动性高血糖更能促进糖尿病患者慢性血管并发症的发生发展。 迄今为止,多数临床和基础研究均针对波动性高葡萄糖对血管内皮细胞的功能损伤,国内外尚无波动性高葡萄糖对血管平滑肌细胞功能的影响的报道。因此,本实验通过大鼠胸主动脉平滑肌细胞株A7r5细胞,研究持续低糖(5.5 mmol/L),持续高糖(25 mmol/L),波动性高糖(5.5/25 mmol/L交替)对VSMCs增殖、凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达量的影响,探讨波动性高糖对平滑肌细胞增殖和凋亡的影响及可能机制。 实验方法: 1.应用大鼠胸大动脉平滑肌细胞株A7r5(细胞株购自购自中国培养物典藏中心)。将冻存的血管平滑肌细胞株A7r5投入37℃温水中,摇动使尽快解冻。吸出细胞悬液并加入DMEM培养液10 mL,混匀,1000转/min离心5 min,弃上清用培养基培养稀释混匀,接种于培养瓶中,37℃5% CO2孵箱中孵育。取处于对数生长期的细胞分别接种于50 ml培养瓶和96孔培养板培养48小时,将上述培养细胞更换于无血清培养基中培养24小时,使细胞处于饥饿状态同时细胞同步于G0/Gl期,然后分三组①低糖组:5.5 mmol/L葡萄糖组;②高糖组:25 mmol/L葡萄糖组;③波动性高糖糖组:白天5.5 mmol/L葡萄糖和25 mmol/L葡萄糖,每3 h高糖2 h低糖交替3次,高糖过夜。共培养24 h。 2.用MTT法检测持续高糖,持续低糖,波动性高糖(低糖高糖交替)孵育下细胞的增殖活性。 3.通过AnnxenV-FITC检测高糖,持续低糖,波动性高糖(低糖高糖交替)孵育下细胞周期的变化。 4.取处于对数生长期的细胞,Western blot技术检测持续高糖,持续低糖,波动性高糖(低糖高糖交替)孵育下细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。 结果: 1.用MTT法检测VSMCs的增殖活性,发现波动高糖组和持续高糖组较低糖组增殖活性明显增强,OD值分别为0.205±0.017,0.186±0.011和0.172±0.009,差异具有统计学意义(P0.01)。而波动高糖糖组增殖活性较持续高糖组也明显增强,差异有统计学意义(P0.01)。 2.用流式细胞仪检测细胞各周期的时相分布,显示各浓度葡萄糖作用于VSMCs 24 h后,持续高糖、波动性高糖组S期细胞百分率较低糖组显著增高(分别是37.57±1.54% vs 34.00±1.45%, P 0.05,41.92±1.76% vs 34.00±1.45 %, P0.01),而波动性高糖(低糖高糖交替)较持续高糖组增高也具有统计学意义(41.92±1.76 % vs 37.57±1.54 %, P0.05);波动性高糖G0/G1期细胞百分率比较持续高糖和低糖组均有明显降低(分别为47.46±4.04 % vs 54.75±1.70%,P0.005,47.46±4.04 % vs 59.07±4.03 %,P0.01),而持续高糖组G0/Gl期细胞百分率与低糖组比较差异无统计学意义(P0.05)。 3.Western blot技术检测VSMCs凋亡调节Bcl-2、Bax蛋白表达量的影响,结果显示高浓度葡萄糖(25 mmol/L)和波动性高糖(5.5/25 mmol/L)能使Bcl-2蛋白的表达明显增强(P0.01),且波动性高糖较持续高糖组表达亦有统计学意义(P0.05)。波动性高糖,持续高糖Bax的表达量明显高于低糖组(P0.01)。波动性高糖组Bax的表达量亦明显高于持续高糖组(P0.01)。波动性高糖,持续高糖Bcl-2/Bax的值明显高于低糖组(P0.01)。波动性高糖组Bcl-2/Bax的值明显高于持续高糖组(P0.01)。 结论: 1.与低糖组相比,持续高糖和波动性高糖均可促进VSMCs增殖;其中波动性高糖较持续性高糖对血管平滑肌细胞的增殖具有更强的促进作用。 2.与持续高糖相比,波动性高糖可使VSMCs G0/G1期细胞比例降低,S期细胞比例增加,通过细胞周期转化促进VSMCs增殖。 3.与持续高糖相比,波动性高糖可增加VSMCs凋亡相关蛋白Bcl-2表达及Bcl-2Bax比值,可能对VSMCs凋亡具有抑制作用。 4.本研究首次在VSMCs上证实波动性高糖较持续性高糖更能促进VSMCs增殖,并可能通过对凋亡相关蛋白的调控抑制其凋亡,因此可能加速糖尿病患者动脉粥样硬化的发生发展。


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