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多重耐药铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌耐药基因研究

赵媛媛  
【摘要】: 目的:应用聚合酶链反应(PCR)方法检测我院呼吸重症监护室分离到的多重耐药铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因和整合子耐消毒剂基因qacE△1-sul1存在状况。采用多基因聚类分析方法进行多重耐药菌株亲缘性分析。 方法:1标本来源收集我院呼吸重症监护室(RICU)自2008年6月至2009年12月间因慢性阻塞性肺疾病急性加重期,急性呼吸窘迫综合症,老年重症肺炎,颅脑疾病继发感染行有创机械通气患者下呼吸道分离的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌。 2药敏试验采用K-B法鉴定分离的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、环丙沙星、米诺环素、多粘菌素B 9种抗菌药物的敏感性。并根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)2004年版要求进行抗菌药物敏感性判断。本研究中多重耐药菌株的选取标准为对上述抗生素中3类或3类以上药物耐药。本研究中共收集到33株多重耐药铜绿假单胞菌和16株多重耐药鲍曼不动杆菌。 3 PCR扩增模板制备采用蛋白酶K消化法制备模板液,并将制备好的模板置于-20℃冰箱保存。 4基因检测应用聚合酶链反应法,共检测多重耐药铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌9种耐药基因,包括β-内酰胺酶基因(blaTEM,blaSHV,blaPER,blaDHA, blaIMP, blaVIM,blaOXA-23,blaOXA-24)和整合子耐消毒剂基因(qacE△1-sul1)。将聚合酶链反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳,出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性,用凝胶成像系统观察电泳结果并摄像保存。 5核酸序列测定将整合子耐消毒剂基因qacE△1-sul1PCR阳性扩增产物回收后送测序。测得序列与GenBank核酸库已登录的序列作比对。 6菌株亲缘性分析采用多基因聚类分析法,以多重耐药铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的耐药基因为分子标志做检测结果的样本聚类分析。 结果:1抗菌药物敏感性试验结果33株多重耐药铜绿假单胞菌对多粘菌素B100%敏感,其对阿米卡星和美罗培南耐药率均为45.45%,对其余几种抗生素的耐药率较高,均在50%以上。16株多重耐药鲍曼不动杆菌对多粘菌素B 100%敏感,其对头孢哌酮/舒巴坦和米诺环素的耐药率较低,分别为25.00%和31.25%。对其余几种抗生素的耐药率均达到50%以上。 2耐药基因检测结果33株多重耐药铜绿假单胞菌β-内酰胺酶基因检测果: blaTEM阳性8株(24.24%),blaVIM阳性6株(18.19%),blaIMP阳性3株(9.09%),blaSHV阳性2株(6.06%), blaDHA阳性5株(15.15%),blaOXA-23, blaOXA-24,blaPER均未检出,整合子耐消毒剂基因检测qacE△1-sul1阳性28株(84.85%)。16株多重耐药鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因检测果:blaOXA-23阳性5株(31.25%),blaTEM阳性2株(12.5%),blaDHA 2株(12.5%),blaOXA-24 1株(6.25%),blaPER 1株(6.25%), blaSHV,blalMP,blaVIM均未检出。整合子耐消毒剂基因检测qacE△1-sul1阳性16株(100%)。 3核酸序列测定整合子耐消毒剂基因qacE△1-sul1测得序列经比对与美国核酸库已登录的序列均相同。 4菌株亲缘性分析以多重耐药铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的耐药基因为分子标志做检测结果的聚类分析。33株多重耐药铜绿假单胞菌中1,23,27为同一克隆株,同时携带耐药基因blaVIM和qacE△1-sul1;12,25,26为同一克隆株,同时携带耐药基因blaTEM和qacE△1-sul1;2,5,6,8,16,19,21,24,29,30,32,33为同一克隆,均携带整合子耐消毒剂基因qacE△1-sul1。16株多重耐药鲍曼不动杆菌中3,8,11为同一克隆株,同时携带耐药基因blaOXA-23和qacE△1-sul1;5,6,13,14,15为同一克隆株,均携带整合子耐消毒剂基因qacE△1-sul1。多基因聚类分析发现存在克隆传播现象。 结论:我院呼吸重症监护室多重耐药铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌携带多种β-内酰胺酶基因,其中多重耐药铜绿假单胞菌以携带blaTEM基因为主,多重耐药鲍曼不动杆菌以携带blaOXA-23基因为主。多重耐药铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合子携带率很高。我院呼吸监护室消毒剂耐药现象严重,并发现存在克隆传播现象,应引起临床重视。


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