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百草枯中毒大鼠肾组织突变型P53和Fas/Fas-L的表达及促肝细胞生长素的治疗干预研究

曹宗迅  
【摘要】: 目的:百草枯(paraquat, PQ)是目前世界范围内广泛使用的有机杂环类接触性除草剂。随着百草枯在我国农业上的广泛应用,PQ中毒也日趋增多。百草枯除草效果好,但对人畜均有较强毒性,可以经消化道吸收、皮肤接触及呼吸道吸入等途经进入体內,造成急性中毒,且中毒致死量小,病程发展快。百草枯进入人体后,可引起多个脏器的损害,其中以肺脏为主,其次是肾脏和肝脏。目前尚缺乏百草枯特效解毒剂以及有效降低毒物毒性的治疗手段。PQ主要以原形的形式经肾脏排出,因此了解其排泄机制及肾脏损伤机制非常重要。本研究通过观察大鼠PQ染毒后肾组织病理变化、测定血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)的变化,及肾组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-PX)的活力和丙二醛(MDA)的含量,并采用免疫组织化学方法观察肾组织中突变型P53蛋白、肿瘤坏死因子家族中Fas蛋白及其细胞表面受体Fas-L的表达,以及促肝细胞生长素(Hepatocyte Growth-promoting Factors, pHGF)对其表达的影响,进一步探讨急性百草枯中毒导致肾损伤的机制及促肝细胞生长素对PQ中毒大鼠肾损伤的治疗作用。 方法:选用健康成年Spragne-Dawley(SD)大鼠180只,雌雄各半,随机分为3组:空白对照组(A组)60只、单纯染毒组(B组)60只、pHGF治疗组(C组)60只。B、C组PQ(25mg/kg)腹腔注射染毒,A组等量生理盐水腹腔注射,之后,C组立即给予pHGF 1mg/kg腹腔注射,每12h一次,最长用药时间为14天,B组给予与C组等量生理盐水腹腔注射。各组分别于1d、3d、5d、7d、10d、14d ,取10只大鼠,乙醚麻醉、腹主动脉取血处死,血液离心后取血清以备测定血BUN、Cr水平;留取左肾上极组织,制成10%肾组织匀浆测定MDA的含量,SOD及GSH-Px的活力;右肾用10%甲醛固定,行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察病理学变化,免疫组化检测肾组织中P53、Fas /Fas-L的表达。 结果: 1大鼠中毒表现:于染毒30min~2hB组大鼠即出现不同程度的中毒症状,包括精神、神经、呼吸、消化和泌尿系统等方面,主要表现为倦怠、嗜睡、烦躁、走路不稳、头颤;呼吸困难、进食水减少、血尿少尿甚至无尿。症状以1~3d最明显,3d后症状逐渐减轻。C组经pHGF治疗组中毒表现较B组减轻,呼吸困难改善,血尿减轻,少尿及无尿时间缩短。 2血BUN、Cr测定( table 1, Fig.53) A组:血BUN、Cr各时段均在正常范围内; B组:血BUN于第1天逐渐升高,1d、3d、5d各时间点与A组比较有统计学意义(P0.05);5d后存活大鼠血BUN逐渐下降,7~14d时段逐渐恢复正常,与A组比较无统计学意义(P0.05); C组:血BUN在1d、3d时段与A组比较具有统计学意义(P0.05);5d、7d、10d、14d时段与A组比较无统计学意义(P0.05); 1d、3d时段较B组降低,有统计学意义(P0.05);5d、7d时段较B组降低,但无统计学意义(P0.05);三组Cr变化比较均无统计学意义(P0.05); 3肾组织匀浆SOD、GSH-Px及MDA变化(table 2,Fig.54-56) 3.1 SOD活性检测(Fig.55) B组:染毒后1d后明显下降,之后缓慢升高,与A组相比,染毒后1d、3d二者差异比较有统计学意义(P0.05),5d、7d时虽明显低于A组,但不再有统计学意义(P0.05),10d、14d时间点SOD活力逐渐增高,与A组比较无统计学意义(P0.05); C组:促肝细胞生长素干预后SOD活力增加,染毒后1d、3d、5d、7d各时间点较B组升高,有统计学意义(P0.05);10d、14d时间点与B组相比无统计学意义(P0.05);与A组相比,1d差异有统计学意义(P0.05),3d达高峰,之后维持在较高水平,5d开始呈下降趋势,3d、5d、7d、10d、14d与A组比较均无统计学意义(P0.05); 3.2 GSH-Px活性检测(Fig.56) B组:染毒后1d和3d时段低于A组(P0.05),5d及以后时段肾组织GSH-Px活力逐渐升高,与A组比较无统计学意义(P0.05); C组:促肝细胞生长素干预后GSH-Px活力增加,染毒后1d和3d时段较B组增高,差异有统计学意义(P0.05),所有时段与A组比较均无统计学意义(P0.05); 3.3 MDA含量测定(Fig.54) B组: 1d、3d、5d、7d、10d时段均高于A组,差异有统计学意义(P0.05),14d时段与A组相较无统计学意义(P0.05); C组:促肝细胞生长素对大鼠肾组织MDA升高有抑制作用,1d和3d时段高于A组,差异有统计学意义(P0.05),5d及以后各时段与A组相较均无统计学意义(P0.05);1d、3d、5d、7d各时段较B组降低(P0.05),10d及以后时段与B组相较无统计学意义(P0.05); 4肾组织HE染色结果 A组(Fig.1):肾小球、肾小管及肾间质结构清晰,未见水肿、空泡变性、浊肿及坏死; B组((Fig.2-7):与A组相比,B组各组织结构清晰度下降,染毒后1d皮质部小管上皮细胞肿胀,小管管腔狭小,间质充血、水肿,肾小球内可见红细胞轻度增多,随时间延长而加重; C组((Fig.8-13):与B组相比,C组肾小球充血水肿减轻,肾小管上皮细胞损伤减轻,3d时即可见再生上皮细胞,肾间质可见炎性细胞浸润。 5免疫组织化学检测结果( table 3, Fig.14-52) 5.1 Fas蛋白在大鼠肾组织中的表达与分布 A组(Fig.14):Fas蛋白无表达或有微弱表达,主要分布在肾小管上皮细胞的胞质中; B组(Fig.15-20):染毒后1d肾组织中Fas的表达即明显强于A组(P0.05),主要分布在肾小管上皮细胞的胞浆中,其表达呈持续高水平,7d有所下降,至14d仍高于A组(P0.05)。 C组(Fig.21-26):促肝细胞生长素抑制了染毒大鼠肾组织中Fas的表达,与B组比较1d时段无统计学意义(P0.05),3d至14d各时段则有统计学意义(P0.05);与A组比较所有时段均有统计学意义(P0.05)。 5.2 Fas-L蛋白在大鼠肾组织中的表达与分布 A组(Fig.27):Fas-L蛋白无表达或有微弱表达,主要分布在肾小管上皮细胞的胞质中; B组(Fig.28-33):染毒后1d肾组织中Fas-L的表达即明显强于A组(P0.05),主要分布在肾小管上皮细胞的胞浆中,其表达呈持续高水平,10d有所下降,至14d仍高于A组(P0.05)。 C组(Fig.34-39):促肝细胞生长素抑制了染毒大鼠肾组织中Fas-L的表达,与B组比较1d时段无统计学意义(P0.05),3d至14d各时段则有统计学意义(P0.05);与A组比较所有时段均有统计学意义(P0.05)。 5.3突变型P53在大鼠肾组织中的表达与分布 A组(Fig.40):突变型P53无表达或有微弱表达,主要分布在肾小管上皮细胞的胞核中。 B组(Fig.41-46):大鼠在染毒1d肾组织中突变型P53的表达即明显强于A组(P0.05),主要分布在肾小管上皮细胞的胞核中,其表达呈持续高水平,10d有所下降,至14d仍高于A组(P0.05)。 C组(Fig.47-52):促肝细胞生长素明显抑制了染毒大鼠肾组织中突变型P53的表达,与B组比较所有时段均有统计学意义(P0.05),与A组比较所有时段均有统计学意义(P0.05)。 结论: 1百草枯腹腔注射染毒可引起急性肾损伤,且主要表现为肾小管上皮细胞的损伤; 2百草枯中毒大鼠体内MDA含量升高、SOD活力下降及GSH-Px活力先降后升,说明过氧化损伤及氧化-抗氧化系统失衡是造成肾损伤的重要机制之一; 3突变型P53和Fas/Fas-L在染毒大鼠肾小管上皮细胞的表达发生了明显改变,说明细胞凋亡可能是百草枯中毒肾损伤的机制之一; 4应用促肝细胞生长素治疗后,可以增加百草枯中毒大鼠肾组织中SOD及GSH-Px活力,降低MDA含量,从而减轻肾组织的过氧化损伤; 5促肝细胞生长素可能通过抑制由突变型P53和Fas/Fas-L介导的细胞凋亡而减轻百草枯中毒所致的肾损伤。


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