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重复经颅磁刺激对帕金森病模型小鼠体内神经干细胞增殖的影响

朱爱萍  
【摘要】: 目的:帕金森病(parkinson’s disease, PD)是一种多发于中老年人的慢性神经系统退行性疾病,目前PD的发病机理仍不清楚,治疗机制亦不完善。无论是药物治疗还是外科手术方法只能部分改善症状,无法有效的防治神经系统的退行性变性,长期疗效并不乐观。因此探寻无创、避免不良反应的新疗法是当前神经科学研究的热点。而促进内源性神经干细胞(endogenous neural stem cells, eNSCs)增殖有助于神经系统损伤的恢复。侧脑室室下区(SVZ)是一个重要的神经发生区,它的神经发生能力可保持终生。eNSCs通常处于静息状态,脑损伤等刺激后,神经干细胞(neural stem cells, NSCs)有一短暂增殖过程,在该时间窗内(在大脑5分钟时开始出现增殖,SVZ区在不同的物种增殖达顶峰时间不同,啮齿类达顶峰的时间为7d-10d)脑缺血损伤后调控NSCs的增殖,迁移,分化等过程,可能为增强大脑的可塑性提供有效途径。eNSCs来源于自体,避免了免疫排斥和伦理道德上的争议,eNSCs在病理状态下,例如疾病或损伤,它们急剧扩增,而且分布的范围非常广泛。这些增生的细胞趋向于自发性地代替那些因病理伤害而损失的神经组织,但这并不能阻止疾病进展或促使疾病恢复。所以近来人们正在寻求一些促进eNSCs增殖方法。重复经颅磁刺激(repetitive Transcranial Magnetic Stimulation, rTMS)为刺激大脑皮质神经元的一种新的、非侵入性、无痛的治疗手段,当给予一组或一个序列的脉冲时,能够调节局部或远隔神经元的活动。近年来已作为神经和心理疾病如PD、运动失调和抑郁等疾病的有潜力的治疗性工具。研究显示高频(1 Hz)和低频(1 Hz)都有一定的抗抑郁样作用,但低频(1 Hz))rTMS的抗抑郁效果更好,临床应用低频刺激较高频刺激更安全,然而这种治疗性作用的机制尚不清楚。此外亦有实验表明rTMS可促进海马eNSCs增殖和脑缺血受损神经功能的恢复。多数实验表明,低频电磁场会促进体内和体外神经细胞增殖。本实验的目的是利用MPTP所致的急性PD小鼠模型,观察1 Hz的rTMS是否能诱导PD小鼠侧脑室室下区eNSCs的增殖,并用高架十字迷宫(Elevated-plus maze, EPM)观察干预1天的PD小鼠是否有情绪障碍。 方法:①动物:封闭群清洁级健康雄性C57BL/6J小鼠由河北医科大学实验动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法:选用清洁级健康C57BL/6J小鼠72只,8-12周龄,雄性,体重20g左右。背部皮下注射MPTP (15mg/kg,溶于生理盐水中)4次,每隔2h 1次,制作急性小鼠PD模型。随机将小鼠分为4组:盐水对照组(NS),PD模型组(PD),假磁刺激组(s-rTMS),磁刺激组(rTMS),rTMS组给予相应的rTMS;s-rTMS给予同样的环境,但不暴露于磁场下;PD组不给予任何处理;NS组颈背部皮下注射与PD组相同的生理盐水,在MPTP最后一次注射24小时,在一般行为学和EPM检测后,将小鼠置于一长圆形器具中,头部暴露于标准磁头(最大输出强度为3.7Tesla)下,磁头中心对准小鼠头部正中,距头顶的高度为1.5cm,刺激频率为1Hz,刺激强度为阈上20%,刺激5个序列,每个序列刺激25次,共125次,每个序列之间休息2 min,分别治疗1、3、7天。③实验评估:rTMS干预前和干预后分别进行EPM实验,对急性PD模型小鼠进行1天的rTMS干预,对其情绪障碍进行评价。在侧脑室的室管膜及其室下区检测nestin阳性细胞。 结果:1、一般行为学观察:小鼠在每次注射MPTP后很快出现震颤、竖尾、竖毛、后肢张开、步态不稳,随着给药次数的增加,其运动减少、肢体僵硬、步态不稳、反应迟缓的表现越来越明显。每次给药后上述急性中毒症状持续5~6小时,在24小时后基本恢复。2、EPM:①各实验组内在不同时间点的比较:①NS组、PD组、s-rTMS组和rTMS组:在干预前及干预后第1天与第2天,小鼠在开放臂上的时间占总时间的百分比的各时间点间比较均无统计学意义(P0.05)。②NS组、PD组、s-rTMS组和rTMS组相比,各组之间在干预前后小鼠在开放臂上的时间占总时间的百分比的各时间点间比较均无统计学意义(P0.05)。③虽然组内比较统计学上无意义,但干预后的小鼠OT%有较明显的下降。3、巢蛋白(nestin)免疫组化染色结果:①NS组与PD组相比:NS组的1、3、7天nestin阳性细胞数分别为(24.33±5.57)、(22.33±4.50)、(23.00±5.40),PD组1、3、7天nestin阳性细胞数分别为(25.00±3.90)、(50.50±5.13)、(52.67±7.45),NS组与PD组nestin的阳性细胞数第1天相比无统计学意义(P0.05),第3天和第7天相比具有统计学意义(P0.05)。②PD组与s-rTMS组相比:s-rTMS组1、3、7天nestin的阳性细胞数分别为(29.00±2.83)、(47.83±4.02)、(53.00±4.98),PD组与s-rTMS组1、3、7天nestin的阳性细胞数分别进行比较不具有统计学意义(P0.05)。③s-rTMS组与rTMS组相比:rTMS组1、3、7天nestin的阳性细胞数分别为(51.50±9.40)、(64.33±9.07)、(100.50±13.94),s-rTMS组与rTMS组1、3、7天nestin的阳性细胞数分别进行比较具有统计学意义(P0.01)。④PD组与rTMS组相比:PD组与rTMS组1、7天nestin的阳性细胞数分别进行比较具有统计学意义(P0.01),第3天比较亦具有统计学意义(P0.05)。⑤PD组、s-rTMS组与rTMS组nestin的阳性细胞数组内各时间点比较亦有统计学意义(P0.05)。并且细胞数量随时间的延长而增加。⑥eNSCs沿一定的路径逐渐往外迁移,第3天时有一部分迁移到胼胝体,到第7天时有一部分能迁移到大脑皮层。 结论:①MPTP诱导的急性PD模型能促进eNSCs增殖。②rTMS能促进eNSCs增殖。③eNSCs增值具有时间依赖性,1天开始出现增殖,3天增殖旺盛,7天增殖达到高峰。④eNSCs沿一定的路径逐渐往外迁移,第3天时有一部分迁移到胼胝体,到7天有一部分能迁移到大脑皮层。⑤高级十字迷宫实验表明注射MPTP后2天所致的急性PD模型没有发现情绪的异常。


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