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环介导等温扩增技术快速检测果汁中耐热菌的研究

陈静  
【摘要】:酸土脂环酸芽孢杆菌(A.acidoterrestris),简称耐热菌(ATB),是重要的食品工业腐败菌。其显著特点是可以在温度20~70℃和pH2.0~6.0的高温低酸环境下生长。因此巴氏灭菌不能除去此菌。在浓缩果汁中该菌不繁殖代谢,但一旦稀释成低浓度的饮用果汁时,在常温下即代谢产生愈创木酚、卤酚,使果汁口感风味变差、浊度升高、形成沉淀导致产品品质下降。欧美各国要求每10 g苹果浓缩汁中耐热菌的含量小于1个,耐热菌逐渐成为我国苹果汁行业产品出口所遭遇的主要技术壁垒。我国对耐热菌的研究属于起步阶段,主要集中在分离方法和控制上。果汁中耐热菌快速检测方面的研究比较缺乏。传统的检测耐热菌的方法操作繁琐、检测时间较长,通常需要4~7 d才能完成,并且灵敏度较低。因此需要建立一种快速、灵敏的检测果汁中耐热菌的方法。 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,简称LAMP)是2000年Notomi等开发出的一种新的核酸扩增技术。该技术以其灵敏度高、特异性强、快速、操作简便、检测成本低等优点在病毒、真菌、细菌以及转基因食品的检测中得到应用。因此,建立LAMP技术检测耐热菌对于控制耐热菌引起果汁变质具有重要意义。 本文确定了耐热菌的培养方法、菌体计数方法,研究了DNA提取方法,并制备了DNA提取液,作为LAMP检测的模板。选择NCBI公布的耐热菌的保守序列AB042057,使用在线软件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)设计LAMP反应的6条引物。 对反应条件进行优化,建立了LAMP的反应体系为:内引物(FIP和BIP)各1.8 mmol/L,外引物(F3和B3)各0.3 mmol/L,环引物(LB)0.9 mmol/L,Mg~(2+)浓度为3 mmol/L,dNTPs浓度5 mmol/L, 8 U的Bst DNA聚合酶大片段,2μL DNA模板。LAMP的反应过程为:先在63℃水浴锅中反应20 min,然后在80℃水浴锅中水浴10 min终止反应。反应结束后,通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀即可判断LAMP反应是否发生,亦可通过琼脂糖凝胶电泳证实反应是否发生。利用LAMP方法对8株耐热菌菌株,6株脂环酸芽孢杆菌属的非耐热菌菌株和13株其它芽孢杆菌进行特异性试验。结果表明,8株耐热菌为阳性,其他19株菌株为阴性。 为了评估LAMP检测耐热菌灵敏度和人工污染检出限,进行了PCR反应,PCR反应的引物是LAMP的两条外引物(F3和B3)。结果表明, LAMP检测耐热菌的灵敏度为2.25 CFU/mL,人工污染耐热菌的果汁的检出限为22.5 CFU/mL。采用试剂盒提取DNA,2 h内即可完成反应。对照PCR耗时3 h,检测耐热菌的灵敏度为225 CFU/mL,人工污染耐热菌的果汁的检出限为2250 CFU/mL。LAMP的灵敏度和检出限是PCR方法的100倍。 比较了6种模板制备方法对LAMP检测果汁中耐热菌的影响。研究表明LAMP方法对制备模板DNA的要求不高。采用热裂解法提取DNA,不仅节约提取时间,而且也将大大降低检测成本。 研究表明LAMP方法将成为可以替代PCR的相对稳定的核酸扩增新技术,为快速检测食源性致病菌构建了一个技术平台。


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