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转尖音库蚊羧酸酯酶及其突变基因果蝇的杀虫剂抗性研究

常海静  
【摘要】:蚊虫由于其特殊的行为、生理以及与人类生活关系紧密而成为传播人类疾病如丝虫病、乙型脑炎、西尼罗河病毒、登革热、疟疾等的重要媒介。杀虫剂对控制这些人类疾病的主要传播媒介起着重要的作用,然而由于这些蚊虫通常具有强大的生殖力和遗传的可塑性从而适应多种严酷自然环境的变化而生存。自20世纪以来多种化学杀虫剂(有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类等)和生物杀虫剂的使用,使得蚊虫与这种环境变化协同进化——通过生理生化多种机制产生抗药性,以适应各种选择压。蚊虫抗药性的分子机理主要包括两个方面:代谢抗药性(如非特异性羧酸酯酶、P450单加氧酶、谷胱甘肽S—转移酶的扩增)和靶标抗药性(如乙酰胆碱酯酶、GABA受体和电压门控钠离子通道的突变)。抗药性问题的出现和加剧不仅缩短了当前正在使用的杀虫剂的寿命,而且由于交叉抗性和抗性机制的多元化,新开发的杀虫剂的功效和使用寿命也被大大降低。 目前,已经证实了果蝇的DmαE7a、家蝇的MdαE7、羊绿蝇的LcαE7及在体外蚊虫的羧酸酯酶B1都可以通过点突变获得有机磷水解酶的活性。然而,尖音库蚊野生种群里还未检测到这种突变体,所以在自然进化中羧酸酯酶B1的突变能否给尖音库蚊带来相应的抗药性仍存在着争议。为解决这一问题,本研究利用果蝇模型,对羧酸酯酶B1的突变对蚊虫抗药性的影响及其遗传进化进行了探讨。 通过生物信息学分析,首先确定了蚊虫羧酸酯酶B1与果蝇羧酸酯酶的氨基酸序列具有较低的同源性(13%-41%)。利用GAL4/UAS系统,通过显微注射成功构建了转尖音库蚊羧酸酯酶B1W271及其突变基因B1L271的果蝇品系,经过P因子定位,分别得到12瓶和14瓶位于Ⅱ和Ⅲ染色体上的转基因果蝇。实时定量PCR显示,B1W271(Ⅱ)、B1W271(Ⅲ)、B1L271(Ⅱ)和B1L271(Ⅲ)四个转基因果蝇品系插入的基因都是单拷贝,在转录水平上也没有显著性差异。利用兔抗尖音库蚊羧酸酯酶B1多克隆抗体,用Western-blot检测了转基因果蝇品系的表达水平,发现B1W271(Ⅱ和Ⅲ)的表达量显著高于B1L271(Ⅱ和Ⅲ),只检测到B1L271(Ⅱ和Ⅲ)微弱的表达量。经过淀粉凝胶电泳对羧酸酯酶进行活性显色,发现B1W271(Ⅱ和Ⅲ)的羧酸酯酶活性明显高于B1L271(Ⅱ和Ⅲ),大约是B1L271(Ⅱ和Ⅲ)的2-3倍,说明B1W271在突变之后丧失了原有的羧酸酯酶活性。通过对马拉硫磷、1605、溴氰菊酯三种农药的生物测定发现,B1L271对马拉硫磷的抗药性明显高于B1W271,对1605和溴氰菊酯都没有产生抗药性,说明B1L271获得了更高的马拉硫磷羧酸酯酶活性(MCE)。据此推测,尖音库蚊很有可能像羊绿蝇等一样走突变抗性进化的途径。本研究结果为进一步研究蚊虫的羧酸酯酶进化奠定了坚实的基础,同时为我国制定合理的媒介蚊虫控制措施、延缓抗性的发生发展和新型杀虫剂的研制开发提供了理论依据和指导。


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