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堆型艾美耳球虫3-1E重组质粒PLGA微球包被技术研究

常丽云  
【摘要】:堆型艾美耳球虫是集约化养鸡场中最常见的球虫种类之一。堆型艾美耳球虫寄生于小肠、属于中等毒力的球虫,给养禽业带来严重的经济损失。鸡球虫病主要依靠药物防治和活疫苗免疫,由于药物的耐药性和药物残留等问题,活疫苗免疫又存在成本高、免疫要求高等缺陷,防治球虫病急需寻求新途径。DNA疫苗的一个显著优势是刺激机体产生广泛的细胞免疫反应和持久的免疫记忆,但裸质粒DNA疫苗注射给药方式不够方便、组织刺激性大、生产成本高;裸质粒DNA疫苗口服免疫在实际应用时由于受到胃酸、胃蛋白酶等对抗原的裂解作用的影响,导致了质粒疫苗的失活,产生的免疫效果较低,常须加大免疫剂量才可获得足够的免疫力。本试验以疏水性材料乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)为研究对象,将鸡堆型艾美耳球虫(E.acervulina)重组表达质粒pcDNA3.1-3-1E包裹,制成微球并用该微球进行动物试验,表明重组表达质粒pcDNA3.1-3-1E能成功的被PLGA包裹并发挥免疫功效。 本试验用PLGA将重组表达质粒pcDNA3.1-3-1E,运用水包油包水(W/O/W)乳化技术制备pcDNA3-3-1E PLGA微球,分别测定微球的形态、粒径、质粒DNA包封率、载药量和释放程度,体外分别进行模拟鸡胃液和肠液试验并且比较肌注裸质粒鸡群和口服免疫鸡群的免疫效果。结果显示微球的包封率,载药百分比分别是82.7%,1.89%,它的粒径80%小于12μm。在模拟鸡的胃肠液累积释放试验中,它的累积释放能力依次为pH 3.0pH 7.4,在模拟的鸡的肠液中,微球30d累积释放81.3%,表明了微球具有一定的缓释效果。裸质粒与微球中质粒超螺旋比例差距不明显, 这表明在包被过程中的超螺旋质粒未发生降解。将PLGA微球口服免疫,重组质粒pcDNA3-3-1E肌注免疫,后1d,10d,30d样品,免疫后1d,10d口服微球免疫组和肌注组各组织均可检测到3-1E基因,免疫后30d,口服微球免疫组各组织均仍检测到3-1E基因,而肌注组仅在注射部位检测到3-1E基因,表明口服的pcDNA3-3-1E PLGA微球能在机体内释放表达且持续释放至少30d。pcDNA3-3-1E PLGA微球免疫后不同时间鸡体外周血淋巴细胞转化水平和不同时间鸡外周血中IgG含量显著增高,表明口服pcDNA3-3-1E PLGA微球免疫能有效的提高雏鸡的细胞免疫和体液免疫水平。 通过增重、病变、卵囊产量、抗球虫指数(ACI )等多项参数来对重组质粒pcDNA3-3-1E PLGA微球免疫效果进行评价。结果显示重组质粒pcDNA3-3-1E PLGA微球口服组攻虫后鸡的卵囊产量下降88.72%,肠道病变记分降低63.96%,并使鸡的相对增重率达96.89%,ACI值为165.19。PLGA能成功地包裹质粒pcDNA3-3-1E,能有效地保护pcDNA3-3-1E在胃肠环境中不受破坏,增强免疫应答。


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