桉树固有内生细菌去除及恢复培养研究

【摘要】：植物内生细菌被广泛应用于植物病害生物防治,桉树青枯病是由茄拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种系统性维管束病害,给桉树产业带来了极大的损失,本研究通过对桉树固有内生细菌去除探索桉树抗病性与内生细菌种群的关系,并且通过恢复培养扩大内生细菌培养范围,为筛选生防菌寻找更广泛的途径。 1桉树茎尖诱导愈伤组织及单细胞培养 采用电镜法检测尾叶桉实生苗茎尖内生细菌,选取长度为1.5 mm左右的尾叶桉茎尖,筛选适宜的茎尖分化培养基及茎尖诱导愈伤组织培养基,机械法分离愈伤组织单细胞,为获得由单细胞培养再生桉树组培苗奠定基础。研究结果发现,电镜观察桉树茎尖未检测到内生细菌;茎尖最适生长培养基为:MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+3%蔗糖+0.8%Agar;茎尖愈伤组织诱导最适培养基为:MS+2 mg/L 2,4-D+3%蔗糖+0.4% Agar,愈伤组织较为疏松,利于单细胞分散;震荡培养后获得均匀单细胞悬浮液,经平板培养成功分离单细胞,经检测细胞内含有内生细菌。所以,机械法分离茎尖愈伤组织单细胞是一种有效的途径,并且为无内生细菌桉树组培苗的获得提供了新的思路。 2热处理和抗生素对桉树固有内生细菌的去除 为了获得无内生细菌干扰的尾叶桉组培苗,本试验采用尾叶桉种子干热和湿热处理、组培苗热处理结合茎尖培养、组培苗抗生素处理三种方法去除内生细菌,并用透明染色法和血球计数法对其体内内生细菌群体存在及数量的变化开展了研究。结果表明,尾叶桉种子经干热45℃1 d、50℃2 d、湿热35℃3 d、45℃1 d、45℃2 d处理后,内生细菌含量均明显低于对照组,约是对照组的1/3,说明对细菌增殖有抑制作用,但经湿热处理后尾叶桉种子萌发率降低,另外45℃高温干热及35℃湿热处理种子后促使种子提早萌发,起到催芽作用;组培苗恒温37℃热处理第20 d、21 d其茎尖内生细菌含量分别为5.33×10~8 CFU/g、4.02×10~8 CFU/g,约是对照组3.43×10~9 CFU/g的1/7,变温恢复热处理后均低于对照组7.70×10~9 CFU/g,当处理温度达到40℃时内生细菌含量最低,为1.63×10~8 CFU/g,约是对照组的1/47,说明抑制效果最好;土霉素、四环素、头孢菌素处理均使桉树体内内生细菌数量增加;所以,热处理对桉树内生细菌有一定的抑制作用,但并不能彻底去除,三种抗生素处理都没有抑制作用;利用透明染色法观察植物叶片内生细菌能更直观有效地检测内生细菌在植物组织内的分布。 3桉树固有内生细菌的激活培养 尾叶桉组培苗采用浇淋菌液法,分别接种浓度为1×10~8 CFU/mL的外源内生细菌枯草芽孢杆菌CN030菌悬液及其代谢液。结果发现,从第5 d起桉树苗接种菌悬液后其体内固有内生细菌开始恢复培养特性,随着分离时间的不同,可培养内生菌的种类也出现差异,获得至少6株优势内生菌株,大多数为革兰氏阳性菌。对其中4种可培养的内生细菌经16S rDNA克隆测序结果分析,1号与亚麻短杆菌Brevibacterium linens和金黄杆菌Brevibacterium aureum同源性达到99.0%,2号与成团泛菌Pantoea agglomerans同源性达到99.5%,3号与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp. subtilis同源性达到99.5% ,4号与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp. subtilis和解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens同源性达到99.1%。而接种CN030代谢液的桉树组培苗中没有分离出可培养内生细菌。经分析可知,外源菌CN030能够激活部分桉树固有内生细菌的培养特性,经高温灭菌后的外源菌代谢液对内生细菌恢复培养没有影响。