大田软海绵酸多克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立

【摘要】：腹泻性贝类毒素(Diarrhetic Shellfish Poisoning, DSP)是一类由有毒甲藻产生的脂溶性多环醚类赤潮毒素,主要成分是大田软海绵酸(Okadaic Acid, OA)及其衍生物。DSP可通过食物链蓄积到滤食性水产动物体内,引起消费者食物中毒。DSP因其世界性分布、高频率爆发性及潜在危害性而成为研究热点,各国以高准确性、高精密度、低检出限及操作便捷为目标,纷纷建立并完善其检测方法,而我国对此研究尚处于起步,技术相对落后,因此,建立DSP快速检测方法,已成为保障水产业持续发展及消费者人身安全的重要研究内容之一。本研究将DSP中主要的致病因子---大田软海绵酸(OA)作为研究对象,开展对OA的免疫学快速检测方法的研究,为建立快速、经济的检测方法提供了可靠的方法基础。 OA完全抗原的制备 利用OA分子中的羧基与蛋白分子中的氨基,采用活泼酯法将OA与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)进行偶联,制备了相应的完全免疫抗原OA-KLH及包被抗原OA-OVA,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法和红外光谱法对人工抗原的偶联效果进行分析,结果表明OA已偶联到载体蛋白分子上,OA的免疫抗原及检测抗原制备成功。 OA多克隆抗体的获得及纯化 用人工抗原OA-KLH对新西兰白兔进行剂量阶梯递进式免疫,即每次加强免疫时适当加大免疫原用量,采用间接ELISA方法测定血清滴度及亲和力的变化。六次免疫后一周取全血,抗血清经饱和硫酸铵和Protein A凝胶层析柱两步纯化处理后获得纯化的多克隆抗体,并用紫外全波长扫描及间接竞争ELISA法验证其纯化效果。结果获得滴度为12800、亲和力高的抗OA血清。抗血清经纯化处理后,紫外光谱扫描表明大量干扰物质纯化效果较好,间接竞争ELISA检测显示经纯化处理后抗体亲和力提高。 OA间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法的建立 建立并优化了大田软海绵酸的ciELISA检测条件:确定了包被抗原及抗体最佳工作浓度分别为1mg/L,纯化抗体稀释倍数为300倍,最佳包被液为0.05 mol/L pH9.6的CBS缓冲盐溶液,包被条件为4℃孵育过夜,竞争时间为1 h,辣根过氧化物酶标羊抗兔的最佳使用浓度为稀释5000倍。由筛选得到的优化条件组合得到,大田软海绵酸在0.977~250 ng/mL浓度范围内,抑制率与浓度对数值呈线性关系,回归方程为y=13.886Ln(x)+11.744,R~2=0.9871, IC15=(1.26±0.32) ng/mL,与鳍藻毒素1(DTX-1)的交叉反应率为46.94%。 样品基质影响的消除 在样品基质影响消除试验中,采用直接稀释法和吹干复溶法进行消除。直接稀释法是在贝样中将按(1:1, w:v)加入80%甲醇,提取液经PBS缓冲盐溶液40倍稀释后直接检测,回收率为72.67%~118.23%,与高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FLD)检测结果有良好的相关性,y=1.0064x-10.234,R~2=0.9347,但此方法对低OA含量的样品灵敏度较差。吹干复溶法是在贝样中将按(1:10, w:v)加入80%甲醇,提取液经氮气吹干,加入等量含10%甲醇的PBS缓冲盐溶液后检测,回收率为77.78%~86.04%。此方法对渤海六种样品的检测结果均与HPLC-FLD相符。