稳定表达乙型脑炎病毒NS1蛋白细胞系的建立

【摘要】：流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的严重的人畜共患传染病,JEV与西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)、圣路易脑炎病毒(Saint-Louis encephalitis virus,SLEV)和墨累河谷脑炎病毒(Murray Valley encephalitis virus,MVEV)同属一个血清群,其广泛分布于东亚和南亚。NS1蛋白作为一种膜功能相关糖蛋白,可能参与病毒的早期复制、RNA复制或病毒组装和释放,是主要的抗原成分之一。NS1蛋白不参与组成毒粒,因而没有中和活性和血凝抑制活性,但它具有可溶性补体结合活性,可在不出现中和抗体的情况下诱生保护力,这种保护作用依赖于抗体的Fc片段。到目前为止,研究人员对NS1蛋白的作用机制尚不十分清楚,这就要求对其结构、功能及特性进行深入的研究。然而,原核细胞表达的NS1蛋白不能形成原有的分子构象,给研究带来局限性,因此需要建立能稳定表达JEV NS1蛋白的真核细胞系。 本研究将乙型脑炎病毒SA14-14-2株的NS1基因密码子优化后,进行人工合成。将NS1基因亚克隆至真核表达载体pCAGneo中并构建重组质粒,对其进行酶切鉴定和测序,该重组质粒为阳性,命名为pCAGneo-opti-JEV-NS1。将该阳性重组质粒转化DH5α感受态细胞,挑取单菌落并扩大培养,在无菌条件下提取质粒。将提取的质粒线性化后调整至合适浓度,转染RK-13细胞,经过G418加压培养,以有限稀释法筛选出一株稳定表达NS1蛋白的细胞系。该细胞系经过RT-PCR、western-blot、IFA、免疫组化等方法鉴定,证实NS1蛋白在细胞内可获得稳定表达。本研究为深入探讨NS1蛋白作用机制提供了可能性,为研究JEV的致病机理和免疫机制奠定了基础。 目前临床上传统的JE诊断方法有一定局限性,如用来检测JEV抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)是建立在抗体和抗原相结合的基础上,可能导致非特异性反应,进而可能导致特异性抗体很难被检出或出现假阳性结果。本研究以上述细胞系为靶细胞,通过补体介导的细胞毒性试验(CDC)成功建立了一种新型的检测抗NS1蛋白抗体的方法。该方法有较高的灵敏度、特异度和敏感性,具有比ELISA方法更好的准确度。由于目前广泛应用的灭活疫苗不能诱导机体产生抗NS1蛋白的抗体,因而该方法也为区别自然感染和人工免疫提供了理想手段,对JEV的流行病学研究具有重要意义。