禽白血病病毒B、E和J亚群基因芯片检测方法的建立

【摘要】：近年来鸡淋巴白血病(AL)一直危害着我国的养鸡业,已成为影响我国蛋鸡业的第一大疫病。由于常规实验室检测方法费时费力,进口ELISA试剂盒价格高昂且准确率并不理想,所以急需一种快速、灵敏、准确、高通量的检测方法来预防和控制AL发生和传播。本研究基于多重PCR技术,建立禽白血病病毒(ALV)的B、E、J亚群的基因芯片分型和检测方法。 根据NCBI已收录的ALV三个亚群的参考毒株cDNA序列,在各亚群特异性基因突变区,两端选取其保守区域,设计合成三个亚群的通用上游引物1条,以及B、E亚群的通用下游引物和J亚群下游引物各1条,将上述引物用Cy3标记,建立多重PCR体系;参考目的序列内部的三个亚群各自的保守区域,选择亚群之间基因突变位点多的区域,设计5条寡核苷酸探针,合成过程中在每条探针的5’端先加入若干个碱基T,使探针长度达到35mer左右,再进行氨基化修饰,将合成好的探针点制在醛基化玻璃基片上,制作寡核苷酸探针基因检测芯片;以寄主细胞DF-1中提取传代ALV的cDNA,以及合成NCBI收录的各亚群参考毒株的cDNA序列作为检测模板,利用Cy3标记的PCR扩增产物,与基因芯片进行杂交反应,扫描结果。对基因芯片进行特异性、灵敏度实验,并对50份临床样品进行检测。 经杂交反应后,芯片能够准确检测并分型三个亚群的参考毒株,其检测灵敏度能够达到10~2个基因拷贝,能够同时检测到三个亚群参考毒株的多重PCR产物,且与禽类常见的四种病毒均无交叉反应。对临床样品检测的结果与ELISA抗体检测结果相比符合率高。本研究结果证明,基因芯片技术是一种有效地对ALV的B、E和J亚群进行检测和分型的方法,且具有较高的特异性和灵敏度,为今后在临床应用中快速鉴别诊断ALV等免疫抑制病提供可行性。