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苏云金杆菌高效菌株的筛选及固体发酵研究

刘云飞  
【摘要】:苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前应用最广研究最深入的生防微生物。但是Bt制剂在应用过程中仍存在杀虫谱窄、抗逆性差、防治成本偏高等缺点,限制了其进一步扩大应用。为了得到具有应用潜力的自然菌株,本实验室利用分子鉴定的方法,前期筛选得到两株基因型丰富的苏云金杆菌野生菌株Bt CYZ-4和Bt S-19,通过基因型分析,预测其可能为杀虫广谱的野生株。本研究利用生物测定方法系统研究了两菌株对7种常见农林害虫和卫生害虫的毒力及对紫外线和高温等不良环境条件的抗逆能力,同时,对Bt与化学药剂的协同作用方式进行了探索实验。得到了杀虫谱广、抗逆性强的Bt CYZ-4菌株,为了降低生产成本,对Bt CYZ-4菌株的低成本固体发酵技术进行了系统研究;得到以下主要结果: 1.两菌株杀虫广谱,但因基因型不同对不同害虫活性表现出差异。 室内生物测定结果表明,Bt CYZ-4菌株对粘虫(Mythimna separata)初孵幼虫48h的LC_(50)为6.6×10~6 cells/mL,对棉铃虫(Helicoverpa armigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、淡色库蚊(Culex pipiens paliens)初孵幼虫和美国白蛾(Hyphantria cunea (Drury)、苹掌舟蛾(Phalera flavescens)、杨扇舟蛾(Clostera anachoreta)二龄幼虫72h的LC_(50)分别为4.7×10~6 cells/mL、2.25×10~5 cells/mL、2.01×10~5 cells/mL和2.9×10~6 cells/mL、6.6×10~7 cells/mL、1.7×10~6 cells/mL;相同处理的Bt S-19菌株对上述害虫的LC_(50)则依次为3.1×10~7 cells/mL、9.0×10~6 cells/mL、4.1×10~4 cells/mL、3.5×10~4 cells/mL和1.8×10~5 cells/mL、1.7×10~6 cells/mL,对杨扇舟蛾活性较差,这两株菌对美国白蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾和淡色库蚊均表现出了很强的杀虫活性。Bt CYZ-4菌株对粘虫、棉铃虫、杨扇舟蛾和苹掌舟蛾的活性高于Bt S-19菌株,而对美国白蛾、甜菜夜蛾和淡色库蚊则表现了相反的趋势。 2. Bt CYZ-4菌株抗逆性优于Bt S-19。 研究了温度,紫外线处理不同时间两菌株对美国白蛾幼虫活性的变化。分别采用30℃,33℃,37℃,42℃温度梯度处理及30min,60 min,120 min,180 min ,240min和360 min不同处理时间,结果表明两株菌在高温处理下,随着温度的升高和处理时间的延长,活性均呈现出下降趋势。但Bt CYZ-4抗高温的能力明显高于Bt S-19;两菌株紫外线处理随着照射时间的延长,杀虫活性也均明显降低,Bt CYZ-4经紫外线照射6h,二龄美国白蛾幼虫平均校正死亡率为56.7%,活性降低了40%。Bt S-19经紫外线照射6小时,二龄美国白蛾幼虫平均校正死亡率为13.33%,活性降低了81.67%。说明Bt CYZ-4抗紫外线能力明显高于Bt S-19;综合而言,Bt CYZ-4菌株抗逆性优于Bt S-19,应用潜力较大。 3.得到了以玉米淀粉和玉米芯为基质的Bt CYZ-4菌株低成本固体发酵配方。 参考LB培养基C源、N源和矿质元素的组成及比例,通过单因子优化和正交试验,得到了以玉米淀粉为碳源的固体发酵配方,各成分含量为:玉米淀粉1%、氮源A 0.5%、氮源B 2%、酵母粉0.1%、K_2HPO_4 0.075%、MgSO_4 0.035%、CaCO_3 0.05%。利用此培养基,按照4%接种量,30℃发酵培养6d,孢子浓度可达到5×10~9cells/mL;在上述矿质元素含量,接种量,pH不变的情况下,30℃发酵培养6d,以单一玉米芯为培养基质发酵培养Bt CYZ-4菌,含水量为70%时孢子浓度最大。以玉米芯、氮源A和氮源B为基质,按玉米芯7.2g、氮源A 3g、氮源B 3.2g、蒸馏水23.3g时孢子浓度最高,可达到1.6×10~(10)个/g。上述两配方发酵产物浓度优于文献报道的固体发酵水平。 4.苏云金杆菌Bt S-19与高效氯氰菊酯协同作用方式为Bt预处理。 采用Bt预处理及直接混用2种方式施药,室内饲毒法测定了2种药剂对美国白蛾2龄幼虫的活性。结果表明:试虫先用每mL含l×10~6个/mL孢子的Bt S-19菌悬液预处理,1d后再用系列浓度的高效氯氰菊酯处理,其48 h的LC_(50)值为0..76 mg/L,而未经预处理,仅用高效氯氰菊酯处理48 h的LC_(50)值为1.28 mg/L;2种处理在高效氯氰菊酯质量浓度为2. 25 mg/L时对试虫的半致死时间(LT_(50)值)分别为9. 2 h和34. 7 h,两者间增效作用明显。对于直接混用,采用1 x 106个/mL的Bt S-19与6 mg /L的高效氯氰菊醋混剂处理,增效作用明显,72 h的共毒系数为122. 5,此后再增加高效氯氰菊酯的浓度则表现出轻微的桔抗作用。说明先用Bt预处理后再使用高效氯氰菊酯对美国白蛾的作用效果优于二者直接混用。


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