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苏云金芽胞杆菌的分离鉴定及高毒力菌株的研究

苏俊平  
【摘要】:苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种可以形成芽胞和晶体蛋白的革兰氏阳性细菌,属于芽胞杆菌属,在自然界中分布广泛,很多高毒力或具有特异杀虫活性的新菌株不断被发现。本论文围绕苏云金芽胞杆菌新菌株的筛选、鉴定、评价及杀虫基因克隆等方面开展了一系列的研究,主要结果如下: 1.从河北省、内蒙古及吉林省等不同地区共采集367份土样,利用醋酸钠-抗生素筛选法并结合复红染色分离鉴定苏云金芽胞杆菌,共得到75株Bt菌株,出菌率为12.27%。这75株野生菌株的伴胞晶体有菱形、球形、米粒形和不规则形等。 2. PCR-RFLP基因型分析结果表明,这75株Bt菌含有cry1、cry1I、cry2、cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry8N、cry9、cry13-14、cry18、cry22、cry26-28、cry34-35、cyt2和vip3A 18种基因型。其中cry2基因含量最高,占总菌株数的43.24%,cry1I基因位居第二,占36.49%。还有12株菌未鉴定出基因型。 3.通过生物测定,发现了菌株L-2、L-10、L-13、L-17、L-22、SC-39和SC-40对二点委夜蛾(Athetis lepigone)的幼虫均表现出较高的杀虫活性,基因型分析表明这些菌株均同时含有cry1Ac、cry2Ac、cry1I、vip3A这四种杀虫基因,初步证实cry1Ac是对二点委夜蛾起主要作用的基因。 4. Bt YX-1菌株对梨小食心虫(Grapholita molesta)、苹小卷叶蛾(Adoxophyes orana)、苹掌舟蛾(Phalera flavescens)苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、美国白蛾(Hyphantria cunea)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、斜纹夜蛾(Prodenia litura)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)以及小菜蛾(Plutella xylostella)等果树及蔬菜害虫表现出广谱杀虫活性,Bt YX-1菌株对这些害虫幼虫的毒力均高于Bt HD-1菌株。Bt YX-1菌株产生菱形伴胞晶体;SDS-PAGE分析表明该菌株表达的主要蛋白条带分子量约为130kDa和60kDa;基因型鉴定表明,Bt YX-1菌株含有cry1Ac、cry2Ac、cry1I、cry34-35和vip3Aa基因。Bt YX-1的最佳培养基配方为:黄豆饼粉32g/L、花生饼粉30g/L、鱼粉16g/L、蛋白胨6g/L、玉米粉18g/L、酵母粉6g/L、蔗糖1g/L、MgSO_4·7H_2O 0.2g/L、KH_2PO_4 1g/L、CaCO_3 0.5g/L、FeSO_4·7H_2O 0.06g/L、余者用水补足。 5. L-27菌株产生球形伴胞晶体,SDS-PAGE检测显示主要表达130kDa和60kDa的蛋白,基因型分析表明该菌株含有cry8、cry8N、cry22、cry26-28基因。利用PCR方法从菌株L-27中分离克隆了cry8的全长基因。序列分析显示,cry8全长基因含有3525个碱基,编码由1175个氨基酸组成的蛋白质。通过在NCBI上应用BLAST软件比较相似性显示,与已发表的登录号为AY551093.1的cry8基因同源性达99%,已提交GenBank登记,登录号为JQ389477。该基因已被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry8Fa3。


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