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中国地方山羊PRNP、SPRN和37/67-kDa LRP/LR基因研究

周荣艳  
【摘要】:羊痒病是一种传染性海绵状脑病(TSEs),是由正常的宿主细胞型朊蛋白构象改变且在中枢神经系统中积累引起的。本研究从中国地方山羊品种入手,对与TSEs发生与发展相关的三个基因PRNP、SPRN和37/67-kDa LRP/LR进行研究,为从遗传学角度控制山羊痒病的发生提供理论基础,并为中国地方山羊的抗痒病育种提供依据。 利用生物信息学对PRNP基因的系统进化进行研究,对属于26个科56个属的83个物种共计937条PRNP基因编码区序列进行分析,结果表明所有物种PRNP基因编码区长度变异为567-825bp,主要是由于种内或种间重复区的插入/缺失引起的。PRNP基因优先利用终止密码子TGA。在反刍动物中,牛具有最小的核苷酸差异(0.811)和多样性(0.0011)和较小的非同义核苷酸多样性。海豚科具有最小的总突变(3)、沉默突变(2)、非同义突变(1)、平均核苷酸差异数(2.000)、同义核苷酸多样性(π(s),0.00739)和非同义核苷酸多样性(π(a),0.00113)。鼠科具有最大的总突变(349)、沉默突变(94)、非同义突变(253)、平均核苷酸差异数(150)和核苷酸多样性(0.19617)。鼠科和牛科具有较高的非同义核苷酸多样性与同义核苷酸多样性比值π(a)/π(s)(0.673和1.209)。基于不同科或物种PRNP基因,构建的系统发育树除了猫科以外,基本与NCBI上的分类学一致。 对山羊PRNP基因编码区突变位点在中国地方山羊中的分布进行研究,对8个省份11个中国地方山羊品种共计337份血液/肾脏样品,提取山羊基因组DNA,PCR扩增山羊PRNP基因,通过序列测定,对PRNP基因多态性进行分析,以确定PRNP基因的多态性情况以及这些山羊品种对痒病的感染风险。研究发现山羊PRNP基因编码区存在10个氨基酸变异位点(102、127、143、146、154、211、218、219、222和240)和3个同义替代位点(42、125和138),其中R211G和T219I为首次发现。这些氨基酸变异位点共组成28个等位基因和49个基因型,与山羊痒病抗性有关的142M在所研究的山羊群体中未检测到,其他与抗性/潜伏期相关的位点146S、154H和127S分别只在1个个体中检测到,对感染痒病具有保护作用的211Q在22个个体中检测到,重要的痒病抗性候选位点222K在所研究的地方山羊中分布较低。等位基因在中国南北方地区地方山羊品种中的分布存在着差异。研究结果将为评估中国地方山羊患病风险提供重要资料。 对山羊PRNP基因非编码区的序列特征和变异位点进行分析,PCR扩增5’UTR、内含子1和3’UTR,利用获得的序列进行分析,山羊PRNP基因含有2个CpG岛。推测启动子核心区域为4648-5169bp,该区域包括15个转录因子结合位点。预测4个保守基序motif 1、motif 2、motif 3和motif 4序列分别为转录因子YY1、E4BP4、Foxp3和COE1的结合位点。内含子1具有启动子活性。在山羊PRNP基因5’侧翼区发现52个SNPs,3’UTR区发现35个SNPs。对引起转录因子C/EBP alpha结合位点的丢失的2140位点进行多态性分析,结果表明等位基因A(GA非缺失)为优势等位基因,等位基因B(GA缺失)在不同群体中的基因频率在0.1452-0.4000之间。辽宁绒山羊和太行山羊中B基因频率较低,并且没有发现BB基因型。利用荧光素酶报告基因载体研究2140位点变异对启动子活性的影响,表明该位点变异改变了启动子活性。 利用Western blot对PrPc在山羊组织器官中的表达进行研究,PrPc在太行山羊小脑、脑干、丘脑、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉中均表达,尤其在小脑、脑干、丘脑中表达量最高。在肺脏中未检测到表达。双糖基化PrP在所研究的组织中为主要表现形式。利用免疫组织化学技术对PrPc在山羊组织器官中的分布进行研究,在小脑分子层、颗粒层和浦肯野细胞、丘脑与脑干的神经元细胞体、肾脏肾小球和近曲小管、肝脏细胞和脾脏髓系树突状细胞检测到PrPc的表达。 克隆获得了山羊SPRN基因包括完整开放阅读框在内的4237bp,开放阅读框为441bp,编码146个氨基酸。该基因不含TATA盒或CCAAT盒,存在转录因子Sp1、AP-2和YY1的结合位点。利用荧光素酶报告基因载体对启动子活性进行研究,表明在323-1329bp存在调控基因表达的重要转录调控因子结合位点,而在111-323bp间存在着抑制转录调控的调控因子结合位点。在山羊SPRN基因发现36个突变位点,其中启动子区10个,内含子1中3个,编码区7个(5个引起氨基酸变异),15个位于3’UTR。组织表达谱结果表明该基因在山羊大脑和小脑中表达量较高,在睾丸、肠系膜淋巴结和肺脏中有表达但很低,其他组织中未检测到表达。 克隆获得了山羊37/67-kDa LRP/LR基因的基因组序列和完整编码区cDNA序列,获得了全长为13587bp的基因组序列,由7个外显子和6个内含子组成,开放阅读框为888bp,编码295个氨基酸。山羊37/67-kDa LRP/LR基因在241、272和291处与其他易感痒病的氨基酸序列相同。山羊37/67-kDa LRP/LR基因5’侧翼区存在潜在的转录因子Sp1、AP-1和AP-2结合位点,同时存在着TATA盒和CCAAT盒。在山羊37/67-kDa LRP/LR基因发现16个变异位点,其中外显子1第17位的C→T突变影响Hsa-mir-1266,外显子7中第84位A→G突变影响hsa-mir-518c-star。RT-PCR结果显示37/67-kDa LRP/LR mRNA在山羊11个组织中均表达,在大脑、小脑、丘脑和海马组织中表达水平较高。


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