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大肠杆菌不耐热肠毒素对小鼠胚胎稳定性的影响及分子机制的研究

韩冬梅  
【摘要】:大肠杆菌不耐热肠毒素(Escherichia coli Heat-Labile Enterotoxin,LT)是肠产毒大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)分泌的能导致动物肠炎和腹泻的细胞毒性因子。LT由1个A亚基(LTA)和5个B亚基(LTB)组成,A亚基具有ADP核糖基化酶的活性, B亚基能与真核细胞膜GM1神经节苷酯结合。LT除了具有很强的细胞毒性外,还具有较强的免疫调节作用,可以刺激机体产生多种细胞因子,是一种较强的粘膜免疫佐剂。研究发现由产毒大肠杆菌引起的腹泻常伴随妊娠动物的流产,造成动物流产的原因除与内毒素(LPS)对胚胎稳定性影响外,可能还与其它致病因子有关。根据动物胚胎稳定性依赖机体免疫平衡调节的原理和LT的免疫调节及细胞毒性作用,推测大肠杆菌感染性流产可能与LT介导的免疫反应及细胞毒性作用导致的胚胎稳定性下降有关。为弄清LT对动物胚胎稳定性的影响及其分子机制,本实验利用大肠杆菌表达系统制备了重组LT蛋白(包括野生型LT和脱毒突变体LTK63),用重组LT处理妊娠小鼠、巨噬细胞和体外培养的2-细胞胚胎,分别从LT免疫调节作用、激活炎性体作用和细胞毒性作用分析了LT对胚胎稳定性影响。 实验结果表明,利用大肠杆菌表达系统成功地制备了重组LTA和LTB及其突变体LTK63。制备的重组LT具有较强的细胞毒性作用,重组LTB具有与GM1神经节苷酯特异结合的活性。而LTA脱毒突变体LTK63,与预期一样缺乏细胞毒性作用。由此可见制备的重组LT具有明显的生物活性。 为弄清LT对动物胚胎稳定性和子宫胎盘组织免疫调节的影响,用重组LT处理妊娠小鼠。结果表明LT可明显降低小鼠胚胎存活率,明显提高小鼠子宫胎盘组织Th1型细胞因子(IFN-γ,IL-2)的表达水平,而Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)的表达水平没有明显变化,可见LT能使Th淋巴细胞的细胞因子向着不利于胚胎稳定性的Th1型细胞因子方向偏移。同时,LT可明显提高小鼠子宫胎盘组织IL-1β的含量,表明LT可激活子宫胎盘组织巨噬细胞的炎性体,后者可激活细胞Caspase1,催化细胞IL-1β前体的成熟和释放,进而促进子宫胎盘组织的炎性反应。组织免疫化学检测结果显示,LT可明显降低子宫胎盘组织CD8~+T淋巴细胞的数量,小幅提高CD4~+ T淋巴细胞和巨噬细胞的数量。上述结果表明,LT通过破坏Th1/Th2免疫平衡和激活巨噬细胞炎性体干扰胚胎的稳定性。 为进一步证实LT激活小鼠巨噬细胞的炎性体,我们用LT处理LPS致敏的小鼠巨噬细胞系B6细胞,结果表明LT和脱毒突变体LTK63均可促进IL-1β的分泌,表明LT引起子宫胎盘组织IL-1β含量增加与LT激活巨噬细胞炎性体有关。通过比较LT不同亚基对炎性体的激活作用,证明只有A亚基能激活炎性体,而B亚基缺乏激活炎性体的活性。 为探讨LT刺激小鼠巨噬细胞炎性体的信号传导途径,我们采用NALP3(炎性体激活感受器之一)基因敲除小鼠巨噬细胞系和Caspase1(酶切前体IL-1β)基因敲除小鼠巨噬细胞系细胞,分析LT对炎性体的激活作用,结果显示用LT处理LPS致敏的这两个细胞系,IL-1β分泌量均没有明显增加,说明LT激活巨噬细胞炎性体与NLRP3/Caspase-1信号传导途径有关。 为了解LT细胞毒性对小鼠胚胎发育的影响,用LT处理体外培养的小鼠2-细胞胚胎,结果显示:低浓度的LT对桑椹胚和囊胚的发育没有明显影响,但高浓度的LT可使桑椹胚和囊胚发育提前。而LTK63对桑椹胚和囊胚的发育没有明显影响,说明LT的细胞毒性作用可能是影响小鼠早期胚胎发育的重要因素。 综上所述,LT可明显降低胚胎稳定性,促进子宫胎盘组织Th1淋巴细胞因子的表达,降低CD8~+T淋巴细胞在子宫胎盘组织中的数量,使Th1/Th2细胞因子和CD4~+T/CD8~+T淋巴细胞向不利于胚胎稳定性的方向偏移,LT可激活小鼠巨噬细胞炎性体,促进子宫胎盘组织IL-1β的释放,引起组织的炎性反应,这些均为导致小鼠胚胎稳定性下降的重要原因。 本项研究不仅丰富了大肠杆菌性流产致病机制的内容,同时为母畜大肠杆菌性流产的防治提供了重要的实验依据。


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