拟南芥转录因子MYB73抗核盘菌的分子机制研究

【摘要】：由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的菌核病常在世界范围内的粮油、蔬菜等作物生产上造成严重的经济损失。研究植物抗核盘菌的分子机制,对于培育作物抗核盘菌的新品种具有重要意义。本研究中,我们分离鉴定了1个拟南芥抗核盘菌相关基因MYB73,并研究了MYB73在植物抗病反应中的功能,进一步利用酵母双杂交技术,获得MYB73互作蛋白,为完善植物的抗病信号网络和指导病害防治提供理论依据。主要研究结果如下: 1.通过对myb73进行抗病性测定,发现myb73接种核盘菌后其病斑面积明显大于野生型(WT),且myb73中核盘菌SsTUBULIN的表达水平也明显高于WT,明确了myb73为核盘菌敏感突变体。进而获得MYB73超表达植株(OE),经抗病性测定发现MYB73超表达植株对核盘菌的抗性明显高于野生型,分析了接种核盘菌后WT,myb73和OE植株中POD活性和MDA含量,确定MYB73为拟南芥抗核盘菌相关基因。 2.对WT、myb73和OE植株接种致病细菌丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv tomato DC3000,Pst DC3000),结果发现myb73对Pst DC3000抗性增强,且OE对Pst DC3000的感病程度与WT相似,Real time-PCR分析发现,Pst DC3000侵染WT后,MYB73表达明显下调,抗病相关基因PR1,PR3,PR5和PDF1.2的表达在接种不同时间均出现上调,表明MYB73为拟南芥抗Pst DC3000的负调控因子。 3.RT-PCR分析发现,myb73中PR1和PDF1.2表达与WT中没有明显差别,表明MYB73基因功能缺失不直接影响PR1和PDF1.2的表达;myb73中SOD,POD和CAT的表达低于WT,但PAL和PPO的表达高于WT,表明MYB73与抗氧化基因表达相关;myb73中NPR1表达被抑制,同时npr1中MYB73表达被抑制,表明MYB73与NPR1的表达具有相互协同作用;eds5,sid2,npr1和jar1突变体中,MYB73表达低于WT,同时水杨酸(salicylic acid,SA)处理eds5,sid2和nahG及茉莉酸(jasmonic acid,JA)处理jar1突变体后,MYB73表达被诱导,表明MYB73的表达依赖于EDS5,SID2,NahG和JAR1,且受SA和JA信号途径调控。 4.SA、JA和ACC处理WT和myb73不同时间,结果发现WT和myb73中PR1和PDF1.2的表达没有明显变化,ACC处理WT 12 h后ICS1表达上调,但ACC处理myb73 12 h后ICS1表达没有增加,表明MYB73功能缺失抑制了ACC对ICS1的诱导表达。核盘菌接种WT和myb73后,结果发现WT和myb73突变体中PR1和PDF1.2的表达没有明显变化,但接种核盘菌1 h后,myb73中ICS1的表达显著下降,表明核盘菌侵染过程中,MYB73功能缺失抑制了ICS1的表达。 5.不同浓度的SA、JA和ACC处理WT和myb73,结果发现100μM的JA处理后,myb73根的抑制程度明显小于WT,而SA和ACC处理后,myb73根的生长和下胚轴的生长与WT相似,表明MYB73功能缺失减弱了JA对拟南芥根的抑制作用。 6.HPLC分析发现,myb73中的SA含量与WT没有明显差别,但核盘菌侵染24 h后myb73中的SA含量明显低于WT;ELISA分析发现,myb73中的ABA含量明显低于WT,而核盘菌侵染24 h后myb73和WT中的ABA含量均出现上调,但myb73中ABA的含量依然低于WT,说明MYB73功能缺失抑制了SA的诱导合成和ABA的积累。 7.本研究构建了MYB73的诱饵表达载体,转录活性分析确定MYB73具有很高的转录激活活性,其转录激活区域位于C端。以MYB73为诱饵,利用酵母双杂交体系筛选拟南芥cDNA文库,获得了15个阳性克隆。RT-PCR分析发现,核盘菌侵染24 h后AT1G12080编码基因F12F1.4在WT中表达明显下调,在myb73中表达明显上调,表明MYB73功能缺失破坏了核盘菌对F12F1.4的诱导表达。进一步构建了MYB73和F12F1.4的酵母双杂交载体,初步确定了MYB73与F12F1.4之间存在一定程度的互作。