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小麦抗叶锈基因Lr37的ISSR分子标记

张立荣  
【摘要】: 本研究利用ISSR(内部简单重复序列)技术对Thatcher及22个以Thatcher为轮回亲本的小麦抗叶锈病近等基因系(NILs)进行分析,结果如下: 1.建立了一套适合本研究的小麦ISSR分析的最优化反应体系及反应程序。通过以小麦基因组DNA为模板,对1SSR反应体系及反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化试验。本研究所用反应体系为:25μl反应体系中含有10mMKCl、8mM(NH_4)_2SO_4、10mM Tris-HCl(pH9.0)、NP-40、2.0mM Mg~(2+)、150μM dNTP、200nM引物、60ng模板DNA、2.0UTaqDNA聚合酶。反应程序为第一个循环基因组DNA经94℃预变性3min;40个循环为94℃变性30sec,48℃退火60sec,72℃延伸2min;最后一个循环完成后,在72℃下延伸7min。 2.通过对Thatcher及小麦抗叶锈病近等基因系的ISSR分析找到一个与Lr37基因连锁的ISSR标记。研究采用100个ISSR引物对小麦抗叶锈近等基因系进行了分析,其中绝大多数引物能扩增出清晰可辨的条带。经过多次重复发现有两个引物UBC812和UBC848在小麦抗叶锈基因Lr37近等基因系间表现多态性。当用这两个引物对含Lr37基因的抗病材料VPMl+Trident、Hyak、Madsen及其它不含Lr37基因的感病材料进行检测时,标记UBC812-1200可以从三个含Lr37基因的抗病材料中检测到一条1200bp的多态性带,而在其它感病材料中,没有这条1200bp的条带,初步表明标记UBC812-1200与Lr37基因连锁。而标记UBC848-700不能将不同遗传背景中的Lr37基因检测出来,表明UBC848-700的特异性差,同时说明标记UBC848-700的结合位点与Lr37基因不连锁。 3.为了进一步确定ISSR标记UBC812-1200与Lr37基因连锁的紧密程度,我们种植Thatcher×Lr37/6~*Thatcher杂交的F2代小麦128株,接种Lr37的无毒菌株,抗感比为3:1。提取其单株小麦的DNA,再以引物UBC812进行扩增,发现所有的抗病单株均能扩增出1200bp的特异性条带,而所有的感病单株没有此条带。表明标记UBC812-1200与Lr37基因共分离。


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