ISSR对梨属（Pyrus L.）栽培品种基因组的指纹分析

【摘要】： ISSR分子标记技术是近年来发展起来的一种新的分子生物学技术，目前已广泛应用于高等哺乳动物和农作物相关领域研究。本研究借助ISSR分子标记技术对梨属52个栽培品种进行了DNA水平上的研究，旨在构建其指纹图谱，亲缘关系及其一些品种的指纹鉴定，以期为梨属优良栽培品种的科学利用、品种选育、果树生产及分子标记辅助育种提供参考。主要结果如下： 1．通过系统的比较研究，建立了稳定的具有广泛适用性的梨属ISSR-PCR分析的反应体系及扩增程序。本研究以52个梨属栽培品种的基因组为模板，对ISSR反应体系中的一些重要参数进行了摸索和优化，除退火温度需适当调整外，其他各参数按如下进行均能满足扩增要求。反应体系为：20μL体系中含1×buffer(内含MgCl_21.5mmol·L~(-1))、模板DNA 40～60ng、引物浓度为0.2μmol·L~(-1)、dNTP 200μmol·L~(-1)、TaqDNA聚合酶1U。扩增程序为：94℃5min、退火温度(52℃左右)60s、72℃延伸120s，然后连续39个循环为94℃ 60s、退火温度(52℃左右)60s、72℃延伸120s，完成最后一个循环后，在72℃继续延伸10min，然后在4℃保温，最后通过1.4％的琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物。 2．对各个引物最佳反应体系确立之后，筛选出11个ISSR引物，对52个供试品种进行扩增，共扩增出193个位点，平均每个引物扩增18个位点，其中多态性位点182个，占总扩增位点数的94.3％。 3．初步建立梨属52个栽培品种ISSR指纹。利用11个ISSR引物对52个供试品种进行扩增，其中UBC810和845均能将52个供试品种全部区分开，充分显示了ISSR鉴别率高的优越性。 4．共有6个供试品种扩增出特有标记，占供试类型的11.5％。其中属于西洋梨系统的2个品种，分别为三季梨和瓢梨；2个来源于新疆梨的品种，分别为埃昆切克和库尔勒香梨；另外还有身不知和京白梨。 5．梨属栽培品种的遗传多样性 (1)从52个栽培品种中，选出对梨属植物四大栽培系统具有典型代表性的25个品种，利用离差平方和法(Ward's method)对扩增结果进行聚类，结果表明：每一系统的品种首先聚在一起，当阀值为15时，可分为四大类群，分别为白梨系统、秋子梨系统、砂梨系统和西洋梨系统的代表品种。其亲缘关系由近及远为：白梨系统、 秋子梨系统、砂梨系统和西洋梨系统。与传统的形态学分类方法一致。 （2）通过分析 52个供试品种亲缘关系树状图及与其它品种的欧氏距离表明： 苹果梨和白梨系统中的鸭梨、白枝母秧、在梨之间的欧氏距离最小，分别为 5．83、 6．000、6．325。其次与秋子梨系统中的软儿，欧氏距离为6．325；然后与砂梨系统中 早生赤和灌阳雪梨，欧氏距离均为6．782；与西洋梨系统欧氏距离最小的为哈代 （7二H）；表明苹果梨与白梨系统亲缘关系较近。另外在亲缘关系树状图上表明苹果 梨首先与鸭梨、白枝母秧、在梨聚在一起。因此研究认为苹果梨应归属白梨系统。 （3）通过分析亲缘关系树状图及与其它品种的欧氏距离发现：新疆梨被分成多 类，红那禾与白梨系统品种首先聚在一起，新疆库尔勒香梨首先和原产于新疆地区 的花长把、新疆酸梨、猪头梨聚在一起，然后与西洋梨系统中日面红聚在一起。从 而从分于水平表明我国新疆梨供试品种与白梨系统和西洋梨系统有较近的亲缘关 系。研究认为新疆梨为白梨系统与西洋梨系统的种间杂种。 6．ISSR－PCR扩增产物在梨属植物基因组中表现出高度的多态性、稳定性，为 其在梨属植物种质资源研究与分子标记辅助育种中的应用提供了直接的试验证据。