柿（Diospyros kaki Thunb.）优良品种AFLP指纹图谱构建及遗传多样性研究

【摘要】：柿是原产于我国的重要果树，品种繁多，栽培历史悠久，适应性强，分布范围广。由于缺乏统一的命名标准，在长期引种和栽培过程中，柿同物异名和同名异物现象十分普遍，品种间的亲缘关系不明。AFLP(扩增片段长度多态性)是一种新的DNA分子标记技术，具有高效、稳定、可靠的特点，广泛应用于品种鉴定、遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建等方面。为给柿的品种鉴定，种质资源的收集、保存和利用提供依据，本研究在建立柿AFLP分析的银染技术体系的基础上，构建了109个柿优良品种的DNA指纹图谱，对其遗传多样性进行了分析，并初步构建了柿优良品种的核心种质。 1 柿树组织中富含单宁、多糖、酚及色素等物质，适于AFLP分析的柿基因组DNA提取方法为改良CTAB法，提取液为100mmol／L Tris-HCl，pH8.0；20mmol／L EDTA；1.4mol／L NaCl；2％ CTAB；1％PVP40；10mmol／LNa_2S_2O_5；100mmol／Lβ—巯基乙醇(用前加入)。采用该方法提取的柿叶片DNA，经纯化后质量和纯度较高，可用于AFLP分析。 2 通过对各主要影响因素的研究，建立了适于柿树AFLP分析的银染技术体系。 酶切体系总体积中含纯化后的DNA450ng，EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ各3U，37℃酶切3h以上；酶切完成后加入连接液，37℃连接10h以上(或过夜)，然后65℃变性10min；连接产物稀释5倍用于预扩增，预扩增体系中EcoRⅠ和MseⅠ引物均不含选择性碱基；预扩增产物稀释5倍用于选择性扩增，选择性扩增体系中EcoRⅠ和MseⅠ引物均含3个选择性碱基，选择性扩增完成后，加入10μL Loading buffer，95℃变性10min，立即冰浴，置于-20℃下备用；取6.5μL变性后的选择性扩增产物在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳完毕后，对胶板进行固定、脱色、水洗、银染、冲洗、显影、定影及干燥等银染程序。 3 从64对引物组合(EcoRⅠ引物和MseⅠ引物个8个)中筛选出20对多态性高、谱带清晰的引物组合用于供试材料的AFLP分析。20对引物共扩增出1000条清晰可辨的谱带，其中多态性带887条，占88.7％。供试材料不同种和类型(涩柿、甜柿、君迁子、油柿和浙江柿)间多态性带所占比例不同。 4 用20对引物组合构建了120份供试材料的基因型指纹，采用二岐分类法可以将供试的120份材料一一区分开，并且部分材料基因型分别拥有自己的特征带，可以作为该材料基因型鉴定的依据。 5根据研究结果确定了品种划分的遗传距离，并确定五峰牛心柿、干帽盔和舟曲牛心 柿为同一品种:暑黄柿与灰柿为同一品种，老皮革与舟曲火柿为同一品种，而磨盘柿 和帽儿柿也为同一个品种，以上品种均为同物异名。 6聚类分析将供试材料分为两大类群和六个亚类，结果表明甜柿品种与涩柿品种在聚 类结果上没有明显界限，聚类结果与品种地理来源也没有明显的联系，君迁子、油柿 和浙江柿单独聚为一个亚类，与柿品种亲缘关系较远。 7采用逐步聚类分组法，以多态性带为主要指标，结合形态分类学指标及地理来源， 构建了供试品种的核心种质，包括襄阳牛心柿、襄汾扁柿、老皮革、小广团柿、八月 红、磨盘柿、罗田甜柿、五花柿、鲁山牛心柿、火晶柿和南化牛心柿等11个品种， 遗传多样性与形态分类学分析结果表明，所构建的核心种质符合核心种质的要求。