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柿(Diospyros kaki Thunb.)优良品种AFLP指纹图谱构建及遗传多样性研究

王文江  
【摘要】:柿是原产于我国的重要果树,品种繁多,栽培历史悠久,适应性强,分布范围广。由于缺乏统一的命名标准,在长期引种和栽培过程中,柿同物异名和同名异物现象十分普遍,品种间的亲缘关系不明。AFLP(扩增片段长度多态性)是一种新的DNA分子标记技术,具有高效、稳定、可靠的特点,广泛应用于品种鉴定、遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建等方面。为给柿的品种鉴定,种质资源的收集、保存和利用提供依据,本研究在建立柿AFLP分析的银染技术体系的基础上,构建了109个柿优良品种的DNA指纹图谱,对其遗传多样性进行了分析,并初步构建了柿优良品种的核心种质。 1 柿树组织中富含单宁、多糖、酚及色素等物质,适于AFLP分析的柿基因组DNA提取方法为改良CTAB法,提取液为100mmol/L Tris-HCl,pH8.0;20mmol/L EDTA;1.4mol/L NaCl;2% CTAB;1%PVP40;10mmol/LNa_2S_2O_5;100mmol/Lβ—巯基乙醇(用前加入)。采用该方法提取的柿叶片DNA,经纯化后质量和纯度较高,可用于AFLP分析。 2 通过对各主要影响因素的研究,建立了适于柿树AFLP分析的银染技术体系。 酶切体系总体积中含纯化后的DNA450ng,EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ各3U,37℃酶切3h以上;酶切完成后加入连接液,37℃连接10h以上(或过夜),然后65℃变性10min;连接产物稀释5倍用于预扩增,预扩增体系中EcoRⅠ和MseⅠ引物均不含选择性碱基;预扩增产物稀释5倍用于选择性扩增,选择性扩增体系中EcoRⅠ和MseⅠ引物均含3个选择性碱基,选择性扩增完成后,加入10μL Loading buffer,95℃变性10min,立即冰浴,置于-20℃下备用;取6.5μL变性后的选择性扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳,电泳完毕后,对胶板进行固定、脱色、水洗、银染、冲洗、显影、定影及干燥等银染程序。 3 从64对引物组合(EcoRⅠ引物和MseⅠ引物个8个)中筛选出20对多态性高、谱带清晰的引物组合用于供试材料的AFLP分析。20对引物共扩增出1000条清晰可辨的谱带,其中多态性带887条,占88.7%。供试材料不同种和类型(涩柿、甜柿、君迁子、油柿和浙江柿)间多态性带所占比例不同。 4 用20对引物组合构建了120份供试材料的基因型指纹,采用二岐分类法可以将供试的120份材料一一区分开,并且部分材料基因型分别拥有自己的特征带,可以作为该材料基因型鉴定的依据。 5根据研究结果确定了品种划分的遗传距离,并确定五峰牛心柿、干帽盔和舟曲牛心 柿为同一品种:暑黄柿与灰柿为同一品种,老皮革与舟曲火柿为同一品种,而磨盘柿 和帽儿柿也为同一个品种,以上品种均为同物异名。 6聚类分析将供试材料分为两大类群和六个亚类,结果表明甜柿品种与涩柿品种在聚 类结果上没有明显界限,聚类结果与品种地理来源也没有明显的联系,君迁子、油柿 和浙江柿单独聚为一个亚类,与柿品种亲缘关系较远。 7采用逐步聚类分组法,以多态性带为主要指标,结合形态分类学指标及地理来源, 构建了供试品种的核心种质,包括襄阳牛心柿、襄汾扁柿、老皮革、小广团柿、八月 红、磨盘柿、罗田甜柿、五花柿、鲁山牛心柿、火晶柿和南化牛心柿等11个品种, 遗传多样性与形态分类学分析结果表明,所构建的核心种质符合核心种质的要求。


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