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玉米大斑病菌MAPK基因的克隆和功能分析

范永山  
【摘要】:促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK),也称细胞外信号调节激酶(Extracellular-signal kinase,ERK),是一组进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在生物体内的多种细胞信号转导途径中占有非常重要的地位,例如渗透调节、细胞壁合成、形态建成、有性交配、致病性、生长和分化等。目前在许多植物病原真菌中鉴定了MAPK基因,发现在病菌的生长、发育、繁殖和致病性等方面具有重要的调控作用,因此研究植物病原真菌中MAPK途径的功能,不但可以使人们更多地了解病害发生过程,而且每一个与致病性有关的MAPK途径相关基因都可能成为病害防治的目标。玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)是玉米上的一种重要病原真菌,引起的玉米大斑病是玉米上的重要叶部病害。为了明确MAPK途径在玉米大斑病菌中的可能功能,本论文在系统研究MAPK途径在玉米大斑病菌生长、发育、侵染和毒素产生等方面调控作用的基础上,获得了115个MAPK途径调控基因的表达基因片段,并克隆了1个玉米大斑病菌MAPK基因——STK1基因。 1、建立了一套切实可行的检测MAPK活性的荧光素酶/荧光素技术体系,并发现MAPK途径抑制剂U0126和CaM抑制剂TFP对MAPK活性都有显著的抑制作用。 2、玉米大斑病菌的分生孢子的水悬浮液和PD悬浮液在玻璃平板上12h以内、在玉米叶片的上表面和下表面24h以内都可以产生成熟的附着胞,在叶片上附着胞和侵入丝的产生时间晚于玻璃平板,产生数量也少于玻璃平板。在一定湿度条件下,影响玉米大斑病菌附着胞生长和发育的决定因素是温度。附着胞的形成过程除了受气候因素影响外,还与不同菌株间的遗传差异有关。 3、在PDA培养基上,U0126对玉米大斑病菌、玉米黄斑病菌、小麦根腐病菌等10种植物病原真菌的菌落形态和生长速度没有显著影响,可以形成正常的菌丝、分尘孢子,但U0126处理的玉米大斑病菌分生孢子萌发时间晚,芽管短,分生孢子的萌发百分率下降。U0126对分尘孢子萌发的抑制程度随着浓度增加而上升,但随着处理时间的延长而下降。此外,U0126处理后分尘孢子还会发生质壁分离现象。 4、U0126和TFP单独或混合处理对玉米大斑病菌附着胞产生都有一定的抑制作用,抑制作用随着浓度增而增强,随处理时间延长而减弱。但加入cAMP后,它们的抑制作用消失,从而表明,MAPK途径与Ca~(2+)-CaM途径和cAMP途径间即有协同作用,又相互影响,它们之间组成一个复杂的信号网络调控玉米大斑病菌的分生孢子和附着胞发育。 5、U0126处理后,玉米大斑病菌HT-毒素的组成及活性都发生了变化,部分组分的产生受到了抑制,并诱导产生了一些新的毒素组分。抑制剂浓度不同,新组分的种类和含量不同。 6、在含有少量离子的蒸馏水中,U0126对菌丝的细胞膜透性和PAL活性没有显 著影响,但POD和PPO活性变化明显,推测U0126对病菌细胞可能没有直接的毒否 作用,而与病菌的活性氧代谢有关。 8、利用DDRT-PCR和反式Northem杂交技术,获得了1巧条特异于U0126处理的差 异表达基因片段,对4个差别表达簇因片·段进行克隆并测序,获得了长度分别为296bp、 333bp、479bp和60lbp的4条eDNA序列。同源性分析表明,它们与TCA循环、膜内外 物质转移、信号转一导、蛋白质合成、反转录等生命活动的相关基因同源性较高,对这 些基因片段进行深入分析和功能研究,将会对MAPK途径在玉米大斑病菌生长、代谢 和基因表达调节等方面的功能有更全面的了解。 9、利用巢式PCR和RACE技术获得了1个玉米大斑病菌MAPK同源基因一STKI 基因的cDNA序列、部分基因组序列及其两侧序列,在基因内部存在3个内含子。该 基因含有MApK、Ser/Thr蛋白激酶、JNK(Jun一N一 terminal kinase)等同源结构域,与一许 多真菌和动物中与应激反应和致病性有关的MAPK蛋白有较近的亲缘关系和较高的 同源性,在基因组中主要以单拷贝形式存在,发现多数供试菌株中都含有57’K了基因, 但菌株间既具有较强的保守性,又存在一定的序列差异。 10、30pMU0126和TFP对STKI荃因的表达都有一定的抑制作用,浓度降低, 抑制作用不明显。在产生分生袍子前、产生分生抱子时、菌丝的对数生长期和产生附 着胞时都可以检测到STKI基因的表达。


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