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核桃AFLP银染技术体系的建立及指纹图谱的构建

陈静  
【摘要】:AFLP(扩增片段长度多态性)是一种新的DNA分子标记技术,具有高效、快捷、稳定、可靠的特点。核桃是我国重要的干果树种,由于长期实生繁殖,后代变异大,造成单产低、商品质量混杂。我国是核桃的起源地之一,种质资源十分丰富,存在许多特异种质资源,但是对我国核桃属植物的遗传多样性的研究非常缺乏。为核桃的品种鉴定和种质资源保存提供依据,本研究在建立适合核桃的AFLP银染技术体系的基础上,构建了58份核桃供试样品的指纹图谱,并对其遗传多样性进行了分析。主要结果如下: 1.确定了适于AFLP分析的核桃基因组DNA提取为改良CTAB法,其提取液成份为:100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),20 mmol/L EDTA,1.4 mol/L NaCl,2% CTAB,3% PVP_(40),50 mmol/L B-巯基乙醇,10 mmol/L Na_2S_2O_5。粗提后的DNA经RNase除去RNA;苯酚-氯仿抽提一次,氯仿-异戊醇抽提两次,去除蛋白质,得到了浓度大,基本无降解,蛋白质和RNA去除彻底,纯度高、质量好的核桃基因组DNA。 2.通过对内切酶用量、酶切时间、连接时间、稀释倍数等的研究,建立了适于核桃分析的AFLP银染技术体系。在20 μL的酶切体系中,含基因组DNA450 ng,NEB Buffer2 2 μL,BSA 0.2 μL,EcoR Ⅰ(大连宝生物公司)和Mse Ⅰ(NEB公司)各3 U;37℃下酶切4 h;加入接头后,37℃连接10 h以上(或过夜);连接产物稀释5倍后进行预扩增;预扩增产物稀释5倍后再进行选择性扩增;加10 μL Loading buffer,95℃变性10 min,立即冰浴;在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析;银染法检测PCR产物。 3.从64对引物组合中筛选出10对多态性高、条带清晰、分布均匀的引物组合用于材料分析,共扩增出可统计条带560条,平均每对引物扩增带数为56条。其中多态性条带527条,占94.11%。根据材料间的特征带和差异带,建立了58份供试材料(46个核桃品种,8个河北核桃类型,4个核桃楸类型)的AFLP指纹图。 4.应用离差平方和法对10对引物扩增的560条谱带进行聚类分析,建立了58份供试材料的AFLP树状图,结合各样品间的遗传距离(欧式距离)对其遗传多样性进行了分析,揭示了供试材料间遗传背景的相似性及复杂性,为核桃的品种鉴定和产权保护,提供了理论依据。


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