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坪草腐霉病菌除草活性毒素组分的分离鉴定与突变菌株的DDRT差异显示分析

张金林  
【摘要】:坪草腐霉病是一种发病迅速、对草坪破坏力极强的病害。坪草腐霉病菌在高温、高湿条件下对多年生黑麦草等禾本科坪草具有很强的致病性,可以引起坪草的大面积死亡。本试验从多年生黑麦草上分离得到了5株腐霉菌(编号依次为PA1、PA2、PA3、PA4、PA5),通过鉴定,PA1和PA5菌株为瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)。在此基础上对PA1菌株的生物特性、毒素产生的适宜条件、毒素的分离纯化与结构鉴定和毒素产生的差异性表达进行了研究。 通过测定发现,PA1和PA5菌株菌丝生长的最适温度为32~34℃,菌种保存的适宜温度为10~15℃;20℃条件下,在CMA培养基和燕麦粉液体培养基中可以大量产生臧卵器和卵孢子;5~15℃条件下,可以产生孢子囊。将所得5株菌株分别在PD培养基、PS培养基、玉米粉培养基、改良Fries培养基、Czapek-Dox培养基和Richard培养基中进行培养,所得培养滤液、粗毒素对马唐和反枝苋的除草生物活性进行了测定。结果表明,在PD培养基中所产生的毒素除草生物活性最强,在供试的5株菌株中以PA1菌株所产生的毒素除草活性最强。PA1菌株在PD培养基中培养所得粗毒素对马唐、反枝苋、虎尾草、金色狗尾草、野燕麦、稗草、藜、播娘蒿和荠菜9种杂草的生长有明显的抑制作用;对玉米、小麦有轻微药害,而对大豆安全。试验发现,PA1菌株产毒的适宜pH值为7.0,以培养5d的毒素除草活性最强;在100~150r/min条件下,振荡培养所得粗毒素的除草活性要明显高于静止培养。通过测定,在培养过程中PA1菌株对葡萄糖的利用率要明显高于蔗糖。 利用紫外线对PA1菌株的菌丝进行了不同时间的照射处理,得到了18株诱变菌株(PAM1~18)。通过生长速率测定法测定了诱变菌株的生长量,结果发现,PAM1菌株的生长速率最快,其次是PAM2、PAM16、PAM12、PAM4,这5株菌株菌丝的生长量明显高于野生菌株。诱变菌株所得粗毒素对马唐和反枝苋的生长抑制作用结果表明,以PAM1的除草活性最高。对PAM1诱变菌株进行了发酵试验,在72h的发酵过程中发酵液的pH值逐渐降低。用发酵液制备所得粗毒素的除草活性与在150r/min条件下振荡5d所得粗毒素的活性相当,均明显高于静止培养所得粗毒素。 分别用乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷等体积萃取PA1菌株培养滤液并制备粗毒素,除草活性测定结果表明,用乙酸乙酯萃取所得粗毒素的活性最高。通过硫酸铵和乙醇沉降法得到培养滤液中的蛋白质,用蛋白质稀释液处理黑麦草后可引起典型的症状,但对杂草生长没有抑制作用。试验发现,培养滤液中的除草活性物质在高温下不稳定,降低培养滤液的pH值、提高盐浓度均可以提高乙酸乙酯的萃取效率,利用活性炭可以有效的吸附培养滤液中除草活性物质。 利用薄层层析法,将具有除草活性物质在乙酸乙酯:石油醚:乙酸=1:15:0.25的展开剂中可以得到有效分离。通过对所得不同Rf值物质的除草生物活性测定表明,以Rf值为0.74、0.41、0.19的物质除草活性最强,对马唐的生长抑制作用均达95%以上;其次为Rf值为0.68、0.64、0.58、0.35,对马唐的生长抑制作用均为85%。利用高压液相色谱仪分别对Rf值为0.19、0.35、0.74的物质进行制备,得到了具有除草活性的组分,分别为组分Ⅰ、组分Ⅱ、组分Ⅲ、组分Ⅳ。对组分Ⅰ的红外光谱、~(13)C-NMR、~1HNMR分析表明,组分Ⅰ为邻苯二甲酸二甲酯。生物测定发现2mg/mL、4mg/mL的邻苯二甲酸二甲酯对马唐的生长抑制作用分别为65%和95%以上。 利用冷冻离心法从粗毒素和菌丝提取物中分离纯化得到了组分Ⅴ,通过IR、


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