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影响山羊胚胎细胞核移植效果主要因素的研究

王文亭  
【摘要】:本研究系统的探讨了山羊胚胎细胞核移植过程中的几个主要影响因素,以期完善山羊胚胎细胞核移植操作程序和胚胎细胞核克隆胚胎生产体系。研究的主要内容为卵母细胞不同采集方法对采卵效果和卵母细胞发育能力的影响;卵母细胞不同体外成熟培养时间对其体外成熟效果和去核效率的影响;卵母细胞不同去、注核方法对山羊胚胎细胞核移植克隆胚胎体外发育能力的影响;以及不同电融合和激活方法对山羊的卵裂球+去核卵母细胞复合体(EOBC)的融合和激活效果的影响。 在山羊卵母细胞的采集过程中,比较了切剖法和抽吸法从屠宰山羊卵巢表面卵泡采集到的可用卵母细胞数和所获卵母细胞的体外成熟效果。通过研究,采用切剖法,平均每个卵巢可采集到的可用卵母细胞数为4.96枚。采用抽吸法,平均每个卵巢采集到可用卵母细胞数为2.86枚。结果表明,两种采集方法获得的可用卵母细胞数差异显著(P0.05),切剖法优于抽吸法,但两种采卵方法所获得的卵母细胞在体外的成熟效果之间差异不显著(P0.05);在卵母细胞不同体外成熟培养时间对其体外成熟效果和去核效率的影响研究表明,卵母细胞在体外成熟培养18h即可达到核成熟,在成熟18~20h去核可以获得最佳的去核效果。在卵母细胞的去核方法研究中,采用改进的McGrath-Solter去核法和改进的Willadsen去核法对成熟18~20h山羊卵母细胞进行去核,经hoechst33342染色后判断,去核率分别为82.11%和84.68%,两者差异不显著(P0.05)。并且两种去核方法对注核后组建的重构胚的发育影响差异也不显著(P0.05);在对去核卵母细胞进行注核方法的研究中,采用胞质内直接注核法,注核成功率为93.33%,获得的山羊胚胎细胞核移植重构胚的体外培养桑椹胚率为26.98%。采用透明带下注核法注核成功率为90.4%,获得的山羊胚胎细胞核移植重构胚进行体外培养后的桑椹胚率为22.41%。两者在注核成功率上差异不显著(P0.05),而在体外发育桑椹胚率上差异显著(P0.05);在对山羊的卵裂球+去核卵母细胞复合体(EOBC)的电融合和电激活的研究中,对山羊的EOBC施加不同电场强度、电脉冲宽度的电脉冲和不同的脉冲次数,结果表明:当电场强度为1.25kv/cm、电脉冲宽度为30μs、脉冲次数为2次时可以获得最佳的细胞融合率(81.67%)和最佳桑椹胚发育率(29.03%);在对山羊胚胎细胞核移植所获得的重构胚进行不同方法的激活研究中,采用电激活和电激活后再用离子霉素和6-DMAP进行二次化学激活,结果表明,对山羊胚胎细胞核移植所获得的重构胚采用电激活后再用离子霉素+6-DMAP进行二次化学激活所获得的激活率(73.79%)和桑椹胚率(35.53%)均优于单独进行电激活,两者差异显著(P0.05)。


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