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常见细菌性食物中毒快速检测试剂盒研制

王世杰  
【摘要】:细菌性食物中毒严重危害人类健康,预防和控制细菌性食物中毒的重要措施之一是快速、准确的检测致病菌。传统的检测以细菌培养、形态学、生理生化等方法为基础;操作程序复杂、耗时长。研究快速检测势在必行。 本实验首先通过免疫家兔分别制备了沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O157、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的五种抗血清,除副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌抗血清外,其他三种抗血清基本涵盖了该菌绝大多数的致病血清型。将制备的抗血清采用(NH_4)_2SO_4沉淀和SPA层析柱结合的方法进行纯化,结果显示(NH_4)_2SO_4沉淀和SPA层析柱结合纯化的抗体,纯度和活性均可满足标记胶体金的需要。 采用柠檬酸三钠还原HAuCl_4制备了三种不同粒径的胶体金,根据颜色、波长扫描曲线、扫描电镜结果,选择15nm胶体金颗粒标记抗体。通过试验胶体金标记抗体的最低稳定蛋白量为18mg/L,最适pH为pH8.2;根据最低稳定蛋白量和最适pH标记抗体制得免疫胶体金,低温超速离心纯化,通过免疫渗滤装置检测五种免疫胶体金,具有活性。将胶体金垫、层析膜、样品垫、吸水垫组装制成免疫层析条。胶体金垫是将浓度为50D值(520nm)的免疫胶体金均匀涂布在聚酯膜上,冷冻干燥后制得。通过比较选用Millipore公司的HF13504作为层析用膜,质控线采用二抗(羊抗兔)浓度为0.25mg/mL,检测线为纯化的多克隆抗体浓度均为0.2mg/mL;样品垫、吸水垫均采用吸水性好的材料。五种层析条分别检测阳性菌株阳性率均为100%,检测阴性菌株除大肠杆菌O157检测条有非特异性反应外,其它层析条均无非特异性反应;五种层析条灵敏性有差异,但基本可达到10~6cfu/mL~10~7cfu/mL;检测时间短,层析条可在5min左右显示清晰的条带;稳定性良好,封闭在有干燥剂的塑料袋中可常温保存4个月。 单纯的层析条检测灵敏度较低。因此,采用实验室自制的纳米免疫磁颗粒,对1mL的样品浓集,然后采用60℃加热30min将菌体与磁颗粒分离,再用层析条检测。随后将层析条与免疫磁颗粒结合组装成“细菌性食物中毒快速检测试剂盒”。初步应用检测牛肉中的大肠杆菌O157,大肠杆菌O157检测条呈阳性,其它层析条均为阴性,灵敏度比单纯应用层析条检测可提高达1个数量级。 总之,本课题制备了检测沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O157、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的五种免疫胶体金层析条,并辅以免疫磁颗粒组装成“常见细菌性食物中毒快速检测试剂盒”。首次将纳米磁颗粒与胶体金免疫层析条检测相结合,证明该结合具有可行性,并且是一种灵敏度高、特异性强、快速、稳定的检测方法。为制备检测更多种细菌的食物中毒快速检测试剂盒奠定了基础。


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