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昆虫病原线虫发育相关基因的鉴定以及spi-583基因的克隆与表达

夏颖伟  
【摘要】:斯氏属(Steinernema)与异小杆属(Heterorhabditis)昆虫病原线虫(Entomopathogenic Nematode)是国际上新型的生物杀虫剂,其感染期幼虫在食物信息的诱导下恢复、发育以及大量繁殖,在这类线虫的产业化培养中发挥着重要作用。了解线虫在恢复发育过程中差异表达的基因对探讨其代谢途径具有十分重要的意义。 本论文通过构建无菌小卷蛾斯氏线虫Steinernema carpocapsae A24在共生细菌上清液诱导后恢复发育时的cDNA文库,筛选差异表达的基因,并将其中一个与线虫生长发育密切相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因进行了原核表达。 论文叙述了分离共生细菌上清液诱导后恢复发育的Steinernema carpocapsae A24线虫总RNA,通过RLM-RACE(RNA ligase mediated Rapid Amplification cDNA End,RLM-RACE)技术获得了全长的cDNA文库,通过点杂交,筛选到48个差异表达的克隆,经测序和生物信息学分析获得34个DNA序列,这些序列按照蛋白质功能包括多个核糖体大小亚基蛋白(ribosomal protein)、延伸因子(translation elongation factor1-alpha)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine proteinase inhibitor)、细胞分裂蛋白激酶(celldivision protein kinase 5)等。 以Steinernema carpocapsae A24总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得了spi-583基因,将目的基因与pET-15b表达载体进行体外连接,构建了重组表达载体pET-15b-spi-583;经传代实验证明了重组质粒pET-15b-spi-583在重组大肠杆菌中的稳定性;于重组菌的对数生长期前期加入诱导剂IPTG(1mmol/L),25℃下诱导表达8h~12h后,获得分子量约为19.54kDa的融合蛋白;融合蛋白以包涵体形式存在,胞外未有目的蛋白的渗漏表达;利用His·Tag融合标签的免疫印迹检测表明融合蛋白含丝氨酸蛋白酶抑制剂SPI-583。 本研究结果不仅有利于昆虫病原线虫—细菌共生关系的研究,而且将促进这类线虫的产业化。


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