拟南芥抗灰葡萄孢相关基因的克隆和功能分析

【摘要】：灰霉病是一种世界性的重要病害,病原为灰葡萄孢(Botrytis cinerea),其寄主范围广,常造成严重的经济损失。本论文在研究拟南芥不同生态型对不同病原菌抗性反应的基础上,探讨了拟南芥抗灰葡萄孢侵染的表型特征、细胞学证据和生化机制,对拟南芥抗灰葡萄孢基因进行了连锁分析和定位,应用抑制性消减杂交(SSH)和mRNA差异显示—PCR(DDRT-PCR)技术获得了大量拟南芥抗灰葡萄孢的相关基因片段,克隆了2个拟南芥抗灰葡萄孢相关基因,同时通过原核基因的表达初步验证其中1个抗病相关基因对灰葡萄孢的生长有一定的抑制作用。为更好地利用模式植物拟南芥的遗传资源和信息,促进植物抗病基因的克隆和相关作物的遗传改良奠定了良好的基础。 1.通过对拟南芥11个生态型对不同植物病原菌的抗病性反应测定,筛选出了具有抗/感差异表现的拟南芥—病原菌组合。供试40个菌株中,有19个菌株对拟南芥的11个生态型都表现抗/感差异,其中10株为灰葡萄孢菌株。试验选择灰葡萄孢菌株BC18为供试菌株,确定对其表现抗病的Col-0、Ws-0生态型和对其表现感病的Ler生态型为供试拟南芥。Col-0、Ws-0生态型接种灰葡萄孢菌株BC18后表现的抗病症状不同。Col-0生态型接种后表现免疫,Ws-0生态型接种后则出现过敏性坏死斑点。 2.试验对3个拟南芥生态型的细胞组织形态进行显微观察,比较在3个拟南芥生态型的叶片上,病菌的萌发、侵入及扩展的情况,获得了拟南芥Col-0和Ws-0生态型抗灰葡萄孢以及Ler生态型感灰葡萄孢的细胞学证据。同时,试验通过比较拟南芥抗病生态型Ws-0和感病生态型Ler接种灰葡萄孢后寄主防御酶系活性和非酶类物质丙二醛的含量变化,探讨了防御酶系和非酶类物质与拟南芥抗灰葡萄孢侵染的关系。确定了POD、CAT、PPO和PAL活性及MDA含量与拟南芥对灰葡萄孢的抗性密切相关:SOD活性与拟南芥对灰葡萄孢的抗性关系不密切。 3.本研究将抗灰葡萄孢拟南芥生态型Col-0与感病生态型Ler进行杂交,分析F_1和F_2代对灰葡萄孢的抗病表现,确定了拟南芥对灰葡萄孢的抗性受2个基因控制。应用图位克隆技术,确定了与2个抗病基因连锁的分子标记,将抗灰葡萄孢基因(暂命名为BC1和BC2)分别定位于拟南芥第4染色体和第5染色体上。BC1位于CCR1和DHS1之间,分别与CCR1和DHS1相距1.2cM和1.6cM;BC2位于CA72/NGA151和NGA106之间,分别与CA72/NGA151和NGA106相距1.4cM和2.4cM。 4.利用抑制性消减杂交(SSH)技术,获得拟南芥不同生态型接种灰葡萄孢后基因表达的差异cDNA片段。同源性分析表明,接种灰葡萄孢后,诱导了一些与转录、膜内外物质转移、蛋白合成、信号转导等有关的基因表达,并有可能启动多种调控机制,尤其是转录过程中的调控。片段AM-2含有GAF保守区域,与组氨酸激酶传感器有较高的同源性,与拟南芥的乙烯信号转导有关,因此初步判断AM-2序列可能与