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外源CpTI基因在转基因苹果中的表达及特性

周瑞金  
【摘要】: 苹果是世界上最重要的果树树种之一。苹果转基因研究开始于1989年,随后相继有苹果砧木、品种基因转化成功报道,但研究多集中于基因转化,关于外源基因在转化植株中的表达、特性以及外源基因在转化系中的遗传规律等研究尚少,开展此方面研究将加速转基因苹果在生产中的应用和推广。 本试验以转豇豆胰蛋白酶抑制剂(Cowpea Trypsin Inhibitor,CpTI)基因苹果(Malus domestica Borkh.)(包括皇家嘎拉、王林、乔纳金和红富士60个株系)为试材,应用PCR、RT-PCR、荧光原位杂交、室内虫试等方法,研究了外源CpTI基因在苹果转化组培苗中DNA、RNA和蛋白等水平的表达;应用转基因花粉培养、果实蛋白毛细管区带电泳等方法,研究了转基因苹果花粉和果实的特性;通过杂交授粉试验,研究了外源基因在转基因苹果中的遗传规律;通过试管微嫁接方法,研究了标记基因在苹果砧穗间的传导性。主要研究结果如下: 1在60个常规继代培养6~8年的转CpTI基因苹果转化株系中均可检测出CpTI特异基因片断;除2个转化株系在50 mg/L卡那霉素浓度下出现花叶现象,表现缺乏卡那霉素抗性外,其他株系在含相同浓度卡那霉素的培养基中生长正常。 2通过对FISH的相关技术参数研究,初步建立了苹果染色体制备和荧光原位杂交技术体系。以CpTI基因片断为探针,利用该体系在苹果细胞核上成功检出了荧光杂交信号,表明外源基因整合到了转基因苹果的基因组中。 3部分转CpTI基因苹果株系有较强的杀虫和抑虫作用。60个转化株系中有2个株系虫试校正死亡率为100%;28个株系校正死亡率为正值,其中11个株系校正死亡率大于等于50%,经秩合检验分析,有4个转化株系的虫重与对照虫重相比差异显著,表明其有明显抑制幼虫生长发育的作用。 4喂食转CpTI基因苹果组培苗叶片的棉蛉虫体内类胰凝乳蛋白酶活性变化结果表明:不同转基因株系对虫体内类胰凝乳蛋白酶活性的抑制作用存在差异,分别表现为抑制能力较强、较弱或没有抑制能力。其中有9个株系能显著抑制棉蛉虫幼虫体内类胰凝乳蛋白酶活力,表明这些株系具有较好的抑制幼虫生长发育的作用。 5对60个转化株系苹果组培苗进行RT-PCR检测,结果表明转入的外源CpTI基因在43个株系中得到了较高水平的表达,在17个株系中表达强度低。外源基因在转化株系(嘎拉32)中高效表达,经RT-PCR扩增,片断回收,克隆,测序,外源基因在转基因植株中核苷酸表达与Phaseolus vulgaris trypsin proteinase inhibitor gene和Tieganqing Irypsin inhibitor(TI)gene有100%同源性,蛋白表达与proteinase inhibitor-cowpea有100%同源性。 6优化的适宜苹果叶片蛋白质毛细管电泳程序为:采用改良丙酮沉淀法提取蛋白质,电泳过程中温度为25℃,电压为20 kV,0.5 psi进样5 s,电泳时间为17 min,检测波长在280 nm处的蛋白质区带。电泳结果表明:与对照相比有4个嘎拉转化株系在第7.65 min分别出现一条特异吸收峰带。 7转基因苹果花粉离体萌发率(24.47%)低于对照(62.05%),但转基因花粉对卡那霉素的抗性高于对照。扫描电镜观察未发现外源基因的导入对苹果花粉粒形态、大小、纹饰等方面产生明显的影响。 8转基因嘎拉大部分果实中可以检测到nptⅡ酶活性,但不同果实中的nptⅡ酶活性强度有差异,其中nptⅡ酶活性较强的占71.43%,较弱的占21.43%,检测不到的占7.14%;果实蛋白毛细管区带电泳检测结果显示,转基因苹果嘎拉果实中蛋白种类少于对照。 9以嘎拉转化株系与未转化富士苹果进行杂交,对果实种胚培养并利用卡那霉素抗性和PCR检测外源基因存在状况,结果表明杂交实生后代外源基因分离比例1:1,符合由一对显性基因控制的遗传性状的自由分离规律,表明外源基因为一显性基因,呈单点显性遗传。 10转基因组培苗微嫁接接穗以选用继代培养30 d左右,带有2~4片叶片的新梢为宜;适当提高BA浓度有利于提高嫁接成活率,其中以MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L培养基中嫁接成活率最高,达83.3%。以转基因嘎拉、王林、乔纳金和富士作为接穗研究结果表明,不同品种之间嫁接成活率差异不显著。外源nptⅡ基因只在转化植株体内表达,未通过微嫁接在砧穗间产生基因效应。


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