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调控玉米大斑病菌生长发育和致病性的STK基因的克隆与功能分析

谷守芹  
【摘要】: 由凸脐蠕孢菌引起的玉米大斑病是玉米生产上的重要病害之一,常造成严重经济损失。研究表明,MAPK信号转导途径是真菌中普遍存在的细胞外信号转导途径,并对植物病原真菌的生长、发育和致病性有重要的调控作用。本文利用候选基因法克隆了玉米大斑病菌中的3个MAPK基因(STK1、STK2、STK3),分别与调控玉米大斑病菌的渗透胁迫调节、致病性与分生孢子发育、细胞壁合成等3种类型的已知MAPK基因有非常高的同源性。在获得玉米大斑病菌STK1基因突变体的基础上,进行了玉米大斑病菌STK1基因的表达研究,确定了STK1基因在玉米大斑病菌分生孢子发育和渗透胁迫调节方面的重要功能,为研究其他MAPK基因提供了思路和方法。经对玉米大斑病菌STK1基因反义诱导表达突变体的构建,不仅为该基因作为靶基因进行病害防治奠定基础,而且STK1基因正义诱导表达突变体的构建还将为该基因在其它物种中的转化以及研究该基因与其它基因之间的关系提供了材料。对ATMT突变体和黑色素缺失突变体中STK1基因表达的研究,证明了玉米大斑病菌调控生长和发育有着更复杂的机制。本文主要结果如下: 1.利用候选基因法克隆了3个玉米大斑病菌MAPK基因,即STK1,STK2和STK3。其中STK1和STK2基因获得了基因的cDNA全长和DNA全长,STK3基因为一个片段,获得了该基因的部分DNA序列。STK1基因cDNA全长和DNA全长的获得使前期研究获得的STK1基因片段得到完整化,并对GenBank中登录的该基因进行了更新(登录号为AY849317)。 2.对STK1、STK2和STK3基因的结构进行了分析。STK1基因DNA全长1506bp,cDNA全长1071bp,编码356个氨基酸,有9个外显子和8个内含子,外显子1071bp,内含子共435bp;STK2基因DNA全长1277bp,cDNA全长1059bp,编码352个氨基酸,含有5个外显子,4个内含子,外显子共1059bp,内含子共218bp;STK3基因片段长度为591bp,可能存在3个内含子,共172bp,4个外显子总长419bp,该基因的编码序列从该片段的第3位开始,编码区域为417bp,预测编码蛋白中含有139个氨基酸。试验中发现的所有内含子均符合GT-AG法则。 3.对玉米大斑病菌STK1、STK2和STK3三个MAPK基因的同源性和功能进行了分析和比较,其中STK1基因可能主要与渗透胁迫和应激胁迫调节有关:STK2基因主要与病菌的致病性和孢子发育有关;STK3基因主要与细胞壁合成有关。为了明确STK1基因的表达量的变化,本试验获得了长度为1287bp的玉米大斑病菌β-微管蛋白基因片段,该序列与玉米小斑病菌的β-微管蛋白基因同源性均为100%。以该基因为内参,利用半定量RT-PCR技术,研究了高渗条件对玉米大斑病菌STK1基因表达的影响,在高渗处理8h内,STK1基因的表达量比较稳定,但超过8h后,STK1基因的表达量迅速下降。 4.在高渗胁迫条件下,玉米大斑病菌的菌落形态、颜色、生长速度发生严重变化,但STK1基因突变体则变化不明显。 5.利用原核表达载体pET28a(+)及原核表达宿主菌BL21构建了玉米大斑病菌STK1基因的原核表达载体STK1-pET28a(+),并成功进行了STK1基因的原核表达分析。为STK1蛋白的分离和在细胞中的定位研究奠定了基础。Southern杂交结果表明,玉米大斑病菌的STK1基因在基因组中以单拷贝形式存在。 6.在优化玉米大斑病菌原生质体制备和再生条件的基础上,根据基因同源重组原理构建了含有潮霉素磷酸转移酶基因和氨苄青霉素基因两个抗性标记的STK1基因敲除载体,通过PEG介导的原生质体转化,获得了246个抗性转化子,通过使用设计的潮霉素磷酸转移霉基因特异性引物及STK1基因特异性引物对转化子的筛选,得到了一个STK1基因突变体,命名为STM-35。STK1基因敲除突变体STM-35的菌丝灰白色、气生菌丝少,菌落低矮,菌落中部菌丝呈浸润状,菌丝细胞中色素沉积少、菌丝较透明,没有发现分生孢子的形成,提取的HT-毒素对感病寄主叶片的毒力显著下降,致病性分析表明,该突变体的致病性大大降低。 7.基于pSOI质粒构建了玉米大斑病菌STK1基因的反义和正义诱导表达载体,获得了30个反义转化子,其中有5个转化子为反义抑制突变体,它们与STK1基因敲除突变体的表现基本一致。在构建玉米大斑病菌ATMT突变体库的基础上,对与STK1基因突变体在菌落和菌丝形态方面非常相似、也不产生分生孢子的ATMT突变体STAM-26,进行了STK1基因的表达分析,发现该突变体中STK1基因能够正常表达,说明调控玉米大斑病菌菌丝和分生孢子发育的机制非常复杂,并不是由某一条途径单独调控。 结论推测,STK1基因对玉米大斑病菌菌丝的生长发育没有影响,但可能与菌丝中色素等物质的积累有关,并调控病菌分生孢子的发育、HT-毒素的活性和致病性。


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