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水稻激活标签系T-DNA侧翼序列分析

吕亚慈  
【摘要】: 水稻(Oryza sativa L.)是最重要的粮食作物之一,水稻基因组与其他禾本科植物基因组具有良好的共线性,是单子叶植物基因组研究的模式植物。2002年12月国际水稻基因组测序计划已圆满完成,鉴定水稻基因的功能己成为水稻功能基因组学研究的重点内容。通过对突变体的研究确定基因功能是一种最常用而又有效的方法。T-DNA或转座子产生插入突变是建立突变体库的一种重要手段。本研究在已经构建了大规模的水稻基因激活标签突变体库的基础上,优化了PCR-Walking侧翼序列的分离方法,并对该激活标签群体和因组织培养而被激活转座的水稻内源转座子Tosl7的侧翼序列进行分析。通过对激活标签系的RT-PCR分析,表明激活标签载体PER38在水稻功能基因组研究中具有重要作用。得到主要结果如下: 1.对水稻侧翼序列分离的PCR-Walking方法进行了改进,酶切和连接被合并在一个步骤中进行,节省了操作时间,并且不影响PCR的效率。改变了接头(ADAl)的一些核苷酸,减少接头和水稻基因组序列的同源性,同时降低引物间的二聚体产生的概率。将第二次PCR反应体系20μL调整到40μL,既保证了扩增效率又利于DNA回收和序列测定,使扩增效率最高可达87.39%,为大通量的侧翼序列扩增分离奠定了良好的基础。 2.通过对标签插入模式的研究,分析插入标签在水稻12条染色体上的分布,结果表明激活标签载体PER38和水稻内源转座子Tosl7均倾向于插入较大的染色体。对标签插入热点和冷点分析,基因区是T-DNA和Tosl7插入热点,重复区是T-DNA和Tosl7插入的冷点。在功能基因的分布中,T-DNA和Tosl7插入参与细胞代谢类型的基因比例最高,分别占了44.66%和34.20%,其次是抗病防卫基因,插入转录因子的比例最小为4.04%和3.90%。这些数据得出为水稻基因组信息数据库提供更加丰富的信息资源。水稻T-DNA插入突变体的表型分析为水稻基因功能的研究提供了重要线索,突变体的侧翼序列分析将有助分离重要农艺性状的相关基因。 3.通过激活标签系的RT-PCR的分析,与野生型比较,在检测的10个基因中有6个基因明显被激活表达,其T-DNA的插入位点在距离基因上游或下游1.0~4.0Kb内,表明该载体的35S增强子确实起到激活基因表达的作用。PER38载体系统具有激活标签系统的一系列优点,它在功能基因组学研究中具有重要价值。


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