芽孢杆菌N19中性蛋白酶发酵条件及其酶学性质研究

【摘要】： 中性蛋白酶是指其最适作用pH介于6.0～7.5之间的一类蛋白酶,能催化蛋白质肽键水解,具有催化反应速度快,无工业污染,催化反应条件适应性宽等独特的性质和优点。 本研究以酶工程实验室所保存的一株芽孢杆菌(Bacillus)N19为出发菌株,在摇瓶发酵水平上,对其发酵产酶条件进行了研究,确定了其最佳培养基成分及最佳培养条件。研究了不同碳源、氮源、无机盐、金属离子等因素对芽孢杆菌(Bacillus)N19产酶的影响,发现牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、NaCl浓度对产酶的影响较大。对此四因素各选取三个水平进行正交试验,确定芽孢杆菌(Bacillus)N19产酶的最佳培养基成分为牛肉膏11g/L,酵母膏12g/L,蛋白胨20g/L,NaCl 4g/L。通过摇瓶发酵试验,确定其最佳培养条件为:摇床42℃,250 r/min,发酵培养基的起始pH为4.5,接种量2%(V/V),装液量为40mL/300mL,培养44h。 芽孢杆菌中性蛋白酶在37℃发酵后,收集发酵液,经过滤、硫酸铵盐析、SephadexG-25脱盐、DEAE-纤维素-52离子强度梯度层析、Sephacryl~(TM)S-200凝胶过滤等纯化工艺分离纯化之后,经PAGE电泳鉴定得到单一条带,达到电泳纯。比活力提高到6214.7U/mg,纯化倍数为20.1倍,回收率为12.87%。 纯化的芽孢杆菌中性蛋白酶以酪蛋白为底物时的酶学性质为:最适温度70℃,在低于60℃或者高于80℃时,相对酶活力明显下降;该中性蛋白酶在50℃下作用2h,其相对酶活只有26.35%,而60℃只有3.6%,70℃下处理20分钟酶活下降至14.3%;最适pH为6.8,作用范围较宽,在pH6.0～8.0范围内均具有较高的酶活性,pH耐受性比较好;Fe~(2+)对中性蛋白酶有显著激活作用,可使其酶活提高394.65%,EDTA对酶活有一定的抑制作用;以酪蛋白为底物采用双倒数作图法测得Km为3.1×10~(-3)g/mL;SDS-PAGE电泳显示芽孢杆菌中性蛋白酶分子量37.7KDa。 本论文对芽孢杆菌发酵条件的优化、中性蛋白酶的分离纯化、酶学性质做了基础性研究,为其工业化生产打下了基础。