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嗜线虫致病杆菌血腔毒素的纯化及其致病机理的研究

杨君  
【摘要】: 嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)是与小卷蛾斯氏线虫(Steinernemacarpocapsae)共生的昆虫病原细菌,为革兰氏阴性菌,属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。侵染期的昆虫病原线虫能够灵活地寻找到靶标昆虫,将携带的共生菌释放到寄主血腔内。嗜线虫致病杆菌在侵入到寄主昆虫血腔后能够成功地逃避或抑制寄主昆虫的免疫反应并快速杀死昆虫。为深入了解嗜线虫致病杆菌的杀虫机理,明确关键的致病因子,作者应用盐析和制备型非变性凝胶电泳等方法,从嗜线虫致病杆菌HB310菌株的细胞内分离纯化了两种对大蜡螟(Galleriamellonella)幼虫具有高血腔注射活性的蛋白——Tp40(toxin protein of 40 kDa)和Tp60(toxin protein of 60 kDa)。经SDS-PAGE电泳分析,Tp40和Tp60蛋白分别只显示出一条分子量约为42kDa和60kDa的多肽,它们对5龄大蜡螟幼虫48 h血腔注射的LD_(50)分别为68.54 ng/头和181.5 ng/头。 Western印迹分析表明Tp40蛋白与已知的Txp40蛋白同源,并且仅存在于共生菌细胞内。编码T040蛋白的基因开放读码框全长1107 bp(GenBank登录号:EU095326),编码368个氨基酸残基,预测分子量为41.5 kDa,等电点为8.66,与GenBank中的其余13株昆虫病原线虫共生菌所包含的相似基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列比较,同源性分别为85%~99%和70%~99%。Tp40蛋白具有很高的血腔杀虫活性,其基因序列具有较强的保守性。当以不低于(70±0.02)ng/头的剂量注射Tp40,大蜡螟幼虫均在20 min内死亡;注射后试虫马上开始快速爬动,表现出兴奋症状;几分钟后大部分试虫运动减少,头胸部翘起,口器持续一张一合;10 min后试虫表现强烈的痉挛症状,足和口器微颤,体躯前后抽搐,有的扭曲翻滚,最后死亡。试虫尸体发软但无脱水现象,体色不发生改变。继续放置6 h后,发现试虫尸体从其头部到胸部变黑,但身体其它部分不变色。在注射LD_(50)剂量的Tp40蛋白后,试虫体内羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活力都明显的高于对照(尸0.05),而酚氧化酶活力显著低于对照(P0.05)。 经质谱鉴定,Tp60与已知蛋白GroEL高度匹配,故推测Tp60属于GroEL蛋白。注射Tp60的大蜡螟幼虫体色变黑(30 min内),血淋巴呈灰黑色,并且暴露于空气中后不再继续黑化。用Tp60蛋白处理大蜡螟幼虫,其体内多酚氧化酶活性开始急剧升高,6 h之后又急剧下降,直到48 h其活性均显著低于对照;而羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活性明显增强。 对大蜡螟幼虫中肠的组织病理学研究显示:这种42 kDa和60 kDa的蛋白都能够破坏试虫的中肠组织,导致其肠壁细胞出现排列紊乱、脱落和围食膜消失。 据此推测,Tp40和Tp60蛋白可能与嗜线虫致病杆菌对寄主昆虫的免疫抑制有关,寄主中肠组织是其作用靶标之一。


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