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灰葡萄孢钙调磷酸酶基因β亚基及其启动子的克隆与序列分析

贾娇  
【摘要】: 植物病原真菌的生长、发育和致病性均受到真菌的细胞外信号转导途径调控。如:Ca~(2+)途径、cAMP途径和MAPK途径。CNB基因通过去磷酸化作用可对其他信号转导通路进行调节,本论文克隆了CNB基因及其5'上游调控序列,并对其进行了生物信息学分析、拷贝数的验证,构建了CNB基因正反义表达载体,为进一步明确CNB基因与灰葡萄孢病菌的致病性的关系奠定基础。 本试验根据CNB基因核苷酸序列的保守区域设计简并引物,以番茄灰霉病菌BC1菌株的cDNA为模板,通过PCR技术获得CNB基因的部分片段,通过NCBI的同源性分析,在灰葡萄孢EST表达序列标签库中发现两条与该片段同源性达到100%的EST标签,通过DNAMAN软件分析,拼接获得了CNB基因525 bp的cDNA开放阅读框(ORF)。然后根据CNB基因cDNA全长序列设计特异性引物进行PCR扩增,以番茄灰霉病菌BC1基因组DNA为模板,扩增获得了该基因810 bp的DNA全长序列。利用DNAMAN软件对DNA序列和cDNA序列进行对比分析,发现CNB基因cDNA开放阅读框编码174个氨基酸,DNA序列含有3个大小分别为40 bp、120bp和84 bp的内含子,在内含子的边缘都显示出典型的内含子边缘特征序列“GT...AG”。 利用NCBI对CNB蛋白进行分析,结果表明CNB蛋白含有4个EF手型Ca~(2+)结合区域,相对分子量为19.749 8 KD,等电点为4.28,其中含有32个带负电荷的氨基酸,21个带正电荷的氨基酸,不含有半胱氨酰、组氨酸和色氨酸,在进行蛋白纯化时应该选择弱阳离子介质进行离子交换色谱。利用Genome walking技术获得了CNB基因5'上游转录调控序列,通过Softberry软件进行同源性分析,结果表明该序列中具有1个重要的核转录因子NF-Kb结合位点,1个激活蛋白质AP-2结合位点,以及Sp1、E2F、BKLF转录因子结合位点各1个,该启动子具有如此多的转录因子位点,而这些作用元件大多与细胞增殖有关,这否与灰霉的强致病性有关,还需要进一步的研究证明的。 以CNB基因的DNA序列为探针进行Southern杂交试验,结果表明CNB基因在番茄灰霉病菌的基因组中以单拷贝形式存在,为下一步进行CNB基因的敲除或缺失试验,验证CNB基因在灰葡萄孢病菌的致病性中的作用提供了有利的证据。


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