调控玉米大斑病菌生长发育和致病性的CaM基因的克隆与功能分析

【摘要】： 玉米大斑病的控制始终是玉米生产上的一个重要问题,而控制玉米大斑病危害的一个重要前提是要了解其致病过程。玉米大斑病菌的致病过程是玉米大斑病菌和寄主玉米相互识别、相互作用的过程,研究这一特异互作过程中的信号转导机制对深入了解玉米大斑病菌的致病机理,设计新型杀菌剂,提出新的植物病害控制策略具有重要意义。本论文主要研究了Ca~(2+)信号转导途径对玉米大斑病菌分生孢子形态构建及致病性的调控作用。 本文首先利用Ca~(2+)信号转导途径特异性抑制剂确定了Ca~(2+)信号转导途径与玉米大斑病菌的孢子萌发、附着胞形成和致病性相关。研究发现,钙调素抑制剂TFP和钙调磷酸酶抑制剂CsA处理分生孢子,随着浓度的增加,对孢子萌发和附着胞形成过程的抑制作用明显增强;同一浓度下,抑制剂对附着胞形成过程的抑制作用大于孢子萌发过程,抑制剂可使附着胞明显变小甚至不能形成,以上结果表明钙信号传导途径参与了玉米大斑病菌孢子萌发及疏水条件下附着胞形成过程的调控。 根据已知植物病原真菌钙调素(CaM)氨基酸序列保守区域设计简并引物,以玉米大斑病菌cDNA为模板,通过PCR技术获得CaM基因的同源片段,利用SMART-RACE技术获得了CaM的cDNA全长序列。并根据CaM基因cDNA全长序列设计基因特异性引物扩增玉米大斑病菌基因组DNA获得了该基因DNA全长。利用BLASTX软件与GenBank中已知蛋白进行同源性分析,发现该开放阅读框所编码的氨基酸序列与许多真菌如水稻胡麻斑(Cochliobolus miyabenus)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)等的钙调素基因的相似性为95%～100%。因此,初步推测该序列为玉米大斑病菌钙调素基因CaM,所获得的cDNA序列已提交GenBank(登录号为EF010936)。玉米大斑病菌CaM基因DNA全长776 bp,cDNA全长450 bp,编码149个氨基酸,有4个内含子,试验中发现的所有内含子均符合GT-AG法则。 利用genomic walking技术获得CaM基因启动子序列,用Proscan在线软件对启动子序列进行分析,发现该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如TATA-box、Sp1、AP-2和TFIID)。Southern杂交结果表明,玉米大斑病菌的CaM基因在基因组中以单拷贝形式存在。 为了研究钙调素基因对大斑病菌致病性的调控作用,构建了玉米大斑反义诱导表达载体,并对它们的正确性进行了酶切验证。利用PEG介导的转化系统将构建好的含有潮霉素抗性筛选标记的反义表达载体转化到玉米大斑病菌原生质体中,获得了14个抗性转化子,这些转化子能在潮霉素抗性平皿上连续继代培养。通过使用设计的潮霉素磷酸转移霉基因特异性引物和分子杂交进行筛选,得到了2个CaM基因反义表达突变体。在奎宁酸诱导条件下,玉米大斑病菌CaM基因反义表达突变体分生孢子萌发率降低,分生孢子萌发后形成的附着胞多为畸形并且黑色素沉积减少,提取的HT-毒素对感病寄主叶片的毒力显著下降。 利用候选基因法克隆了钙调素下游的钙调磷酸酶A亚基、钙调素依赖性蛋白激酶基因。 钙调磷酸酶A亚基编码525个氨基酸,利用BLASTX软件与GenBank中已知蛋白进行同源性分析发现,所编码的氨基酸序列与许多真菌如小麦颖枯病菌(P.nodorum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)等的钙调磷酸酶基因的相似性为860%～94%。因此,初步推测该序列为玉米大斑病菌钙调磷酸酶基因CNA,所获得的cDNA序列已提交GenBank,序列登陆号为(EF407562)。该基因内部含有6个内含子,分别为116bp、47bp、47bp、47bp、47bp和49bp。 玉米大斑病菌中钙调素依赖性的蛋白激酶有4个不同亚型,通过RACE技术已经克隆出3个钙调素依赖性的蛋白激酶基因的全长,而第4个仅得到部分片段。所获得的cDNA序列已提交GenBank,序列登陆号分别为(EU605885,EU605886,EU605887)。4个不同亚型的钙调素依赖性的蛋白激酶都含有蛋白激酶ATP结合位点和活性位点保守基序。 信号转导途径对玉米大斑病菌孢子形态构建及致病性发挥着重要调控作用。抑制剂实验和钙调素基因反义抑制实验均表明钙调素基因对于玉米大斑病菌形成正常附着胞是重要的,同时钙调素也调控着毒素的合成。而玉米大斑病菌钙信号传导途径的重要组分钙调素依赖的磷酸酶、激酶基因的克隆,为后续认识玉米大斑病菌钙信号途径奠定基础。