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玉米大斑病菌G蛋白和磷脂酶C基因的克隆与功能分析

郝志敏  
【摘要】: 由玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)引起的玉米大斑病是威胁玉米生产安全的重要病害之一,常造成严重经济损失。研究表明,异三聚体G蛋白介导的信号转导途径是真菌中普遍存在的细胞外信号跨膜转导途径,并对植物病原真菌的生长、发育和致病性有重要的调控作用。本文利用候选基因法克隆了玉米大斑病菌中的3个Gα基因(Stga-1、Stga-2、Stga-3),1个Gβ基因(Stgb-1)和1个磷脂酶C基因(StPLC-1),它们分别与已知丝状真菌的相应基因有较高的同源性。在获得玉米大斑病菌Stga-1和StPLC-1基因敲除突变体及Stgb-1基因反义表达突变体的基础上,进行了这些基因的功能研究,确定了Stga-1、Stgb-1、StPLC-1基因在玉米大斑病菌分生孢子发育、渗透胁迫及次生物质代谢调节方面的重要功能,为研究其他信号转导调控基因提供了思路和方法。通过对玉米大斑病菌Stga-1和Stgb-1基因进行原核表达,为这些蛋白特异性抗体的制备以及蛋白质结构和表达规律的研究奠定了基础。本文主要结果如下: 1.利用候选基因法克隆了玉米大斑病菌的3个Gα基因(Stga-1、Stga-2、Stga-3),1个Gβ基因(Stgb-1)和1个磷脂酶C基因(StPLC-1)。其中Stga-1、Stga-2和Stgb-1基因获得了基因的完整开放阅读框(ORF)cDNA和DNA序列,StPLC-1和Stga-3基因仅获得部分基因DNA片段。将Stga-1和Stgb-1基因ORE提交GenBank,获得登陆号分别为No.EF407554和No.EF407555。 2.对Stga-1、Stga-2和Stgb-1基因的结构进行了分析。Stga-1基因DNA全长1249bp,cDNA为1062bp,编码353个氨基酸,有4个外显子和3个内含子;Stga-2基因DNA全长1318bp,cDNA为1071bp,编码356个氨基酸,含有5个外显子,4个内含子;Stgb-1基因DNA全长1296 bp,cDNA为1056bp,编码351个氨基酸,含有5个外显子,4个内含子。试验中发现的所有内含子均符合GT-AG法则。 3.对玉米大斑病菌Stga-1、Stga-2和Stgb-1 3个基因的同源性进行分析的结果表明,Stga-1、Stga-2、Stga-3基因分别归属于3个不同的类群。 4.利用原核表达载体pET-28a(+)分别构建了玉米大斑病菌Stga-1和Stgb-1基因的原核表达载体pET-Stga-1和pET-Stgb-1,继而,以重组质粒转化表达宿主菌BL21并进行了诱导培养,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明STGA-1和STGB-1蛋白已在宿主菌中实现诱导表达。为STGA-1、STGB-1蛋白的分离和蛋白结构、表达规律及细胞定位研究奠定了基础。 5.Southern杂交结果表明,玉米大斑病菌的Stga-1、Stgb-1、StPLC-1基因在基因组中均以单拷贝形式存在。 6.根据基因同源重组原理,以潮霉素磷酸转移酶基因取代Stga-1基因的部分编码区序列,构建了含有潮霉素B抗性标记的Stga-1基因敲除载体。利用重组DNA片段通过PEG介导转化病菌原生质体,获得了潮霉素B抗性转化子,通过潮霉素磷酸转移酶基因特异性引物及Stga-1基因特异性引物对转化子进行PCR筛选,得到了Stga-1基因敲除突变体,并对其中的A-23菌株进行了表型分析。A-23菌株菌丝浅灰色、气生菌丝稠密,菌落低矮,培养15d后菌落中部菌丝呈灰白色毡状,且有浸润状斑点,菌丝细胞中色素沉积少,菌丝较透明,产孢量明显下降。取其菌盘接种于感病寄主叶片,不能导致寄主发病。生物测定结果表明,该菌株的HT-毒素对感病寄主叶片的毒力显著下降;同时,与致病相关的漆酶活性明显减弱。菌株对高渗胁迫的耐受能力明显强于野生型菌株,且其色素代谢发生明显改变。该a交配型菌株不能与A交配型标准菌株杂交产生子囊壳。 7.基于pSO-I质粒构建了玉米大斑病菌Stgb-1基因的反义和正义诱导表达载体。利用反义表达载体pSO-Stgb-1转化病菌原生质体,获得了Stgb-1基因反义表达突变体anti-GB-4,诱导反义表达12h后,突变体的分生孢子萌发率仅为16%,但萌发的分生孢子仍然能够在洋葱表皮上形成正常的附着胞。 8.利用相同的策略构建了StPLC-1基因敲除突变体,筛选后获得突变体菌株C-1。该突变体菌落低矮,气生菌丝膨松,菌苔中间略厚,边缘薄;正面呈灰色,背面墨绿色,菌落边缘整齐。菌株生长速度缓慢,产孢量明显下降;显微观察显示该突变体菌株的菌丝尤其是分枝处形成大量不规则膨大,分生孢子色浅壁薄,极易断裂;将其分生孢子接种于载玻片表面培养24h后,分生孢子萌发率与野生型菌株没有明显差异,大部分芽管出现了不规则膨大,内部的原生质分布极不均匀,浓缩形成小的原生质球。在培养基中添加外源Ca~(2+)后,菌丝体的生长速率恢复至与野生型菌株相当的水平,但其他表型变化没有恢复。对突变体HT-毒素活性生物测定的结果表明,突变体的HT-毒素活性明显减弱,同时病菌在活体感病寄主上的致病力也明显减弱。在漆酶活性的检测中发现虽然该突变体的生长速率明显小于野生型菌株,但漆酶活性没有发生明显变化,甚至有促进漆酶向胞外分泌的倾向。突变体对高渗胁迫的耐受能力强于野生型菌株,显微观察发现突变体菌株在高盐胁迫的培养基中几乎所有菌丝分枝及其末端均膨大为球状。C-1突变体菌株的有性杂交能力与野生型菌株没有差异。 由此推测:1)Stga-1基因与StPLC-1基因共同调控玉米大斑病菌的致病性和毒素合成以及病菌的高渗胁迫反应;2)StPLC-1调控玉米大斑病菌的细胞形态建成,并经Ca~(2+)途径介导调控玉米大斑病菌的菌丝及芽管的极性生长;3)Stga-1基因通过STPLC-1以外的其他效应分子调控病菌的有性杂交、漆酶活性及色素代谢;4)Stgb-1基因调控玉米大斑病菌的分生孢子萌发。


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