玉米大斑病菌交配型基因的克隆与两性菌株的育性分析

【摘要】： 玉米大斑病玉米大斑病(Northern Leaf Blight of Corn)是玉米上重要的叶部病害,主要通过分生孢子侵染玉米导致植株发病。真菌也可以进行有性生殖,通过营养体上分化出的性器官或性细胞相结合,产生有性孢子和其他有性结构,这成为植物病害的另一个主要初侵染源,具有度过不良环境的作用。同时,有性生殖的杂交过程产生了遗传物质重组的后代,有益于增强真菌物种的致病性和适应性。玉米大斑病菌属于异宗配合真菌,包括两种交配型,即交配型A和交配型a。目前,在自然界还尚未发现玉米大斑菌的有性态,但具有不同交配型的菌株对峙培养,通过人工诱导可以产生子囊壳、子囊和子囊孢子。本实验室首次在玉米大斑病菌中发现了两性交配型菌株,即交配型Aa,它具有与A交配型菌株和a交配型菌株杂交都能产生杂交后代的特性。众所周知,有性杂交是导致真菌变异的主要途径之一,玉米大斑病菌交配型的两性化,有可能会提高病菌有性杂交的几率从而提高病菌的变异率。 Debuchy等人认为真菌的有性生殖是由交配型基因(MAT)控制的,本研究以玉米大斑病菌菌株08-06(交配型为A)、菌株08-07(交配型为a)和菌株03-16(交配型为Aa)为主要研究材料。采用CTAB法提取了玉米大斑病菌的基因组DNA,利用候选基因法,根据已公开发表的子囊菌交配型MAT1基因的保守结构域设计简并引物,从菌株03-16基因组中扩增得到了一个长度为1 000 bp左右的MAT1基因的同源片段。然后利用Genome Walking技术得到了MAT1基因的全长,并在该基因的5'端延伸了1382 bp,3'端延伸了776 bp。提取玉米大斑病菌总RNA,反转录成第一链cDNA,通过PCR方法克隆得到该基因cDNA全长。利用DNAMAN软件将cDNA全长与DNA全长进行比对,发现该基因含有一个51 bp长的内含子,cDNA全长1140 bp。生物信息学分析表明,该基因含有一个完整的开放阅读框(ORF),编码379个氨基酸残基,包含一个完整的MAT alpha1 DNA结合域,该结合域属于MAT alpha1家族。MAT1基因蛋白的分子量约为38.3kD,等电点pI5.79,含有143个疏水性残基和236个亲水性残基。利用相同的方法从菌株03-16中扩增到了MAT2基因,并在该基因的5'端延伸了1 765bp,3'端延伸了658 bp。根据DNA全长设计特异性引物,以第一链cDNA为模板,克隆得到了该基因的cDNA全长。利用DNAMAN软件将cDNA全长与DNA全长进行比对,发现该基因含有一个55 bp长的内含子,cDNA全长1 038 bp。生物信息学分析表明,该基因含有一个完整的开放阅读框(ORF),编码345个氨基酸残基,包含一个完整的MATA HMG-box结合域,该结合域属于DNA结合蛋白中HMG-box家族的I类成员,此类成员包含一个单一的HMG box,以高度序列特异性的方式与DNA的小沟结合。该类成员包括真菌的交配型基因产物MC,MATA1和Stel 1。MAT2基因编码蛋白的分子量约为41.8 kD,等电点pI 7.96,含有112个疏水性残基和233个亲水性残基。Southern bloting结果表明,这两个基因均以单拷贝的形式存在于玉米大斑病菌基因组中。 根据所得到的MAT1和MAT2基因设计了交配型基因的特异引物,对部分已知交配型的菌株进行PCR扩增,结果表明,交配型为A的菌株均含有MAT1基因,而交配型为 a的菌株均含有MAT2基因,交配型为Aa的菌株同时含有MAT1和MAT2两个基因。从而为交配型的鉴定提供了准确,简便又省时的分子生物学方法。 通过两性菌株03-16的有性态诱导,发现菌株03-16与A交配型菌株08-06和a交配型菌株08-07对峙培养,均可产生子囊壳、子囊和子囊孢子;虽然菌株03-16自交也可产生子囊壳,但没有发现子囊和子囊孢子。本试验证实了菌株03-16为两性菌株以及自交的败育特性。在菌株03-16中同时克隆得到了交配型MAT1和MAT2基因,表明两性菌株的形成具有遗传物质基础,并从一定程度上支持了真菌的异宗配合向同宗配合进化的假设。可见,玉米大斑病菌交配型的两性化,有可能会提高病菌有性杂交的几率从而提高病菌的变异率。因此探求两性交配型菌株的生物学特性及遗传背景,对深入研究玉米大斑病菌遗传变异及病害防治具有重要意义。