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玉米大斑病菌cAMP依赖性蛋白激酶A基因的克隆与功能分析

王苗苗  
【摘要】: 玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)是玉米上的一种重要丝状病原真菌,引起的玉米大斑病(Northern Leaf Blight of Corn,简称NCLB)是威胁玉米生产的一种重要的叶部病害。研究表明,cAMP信号转导途径在病菌的生长发育和致病过程中发挥重要作用,蛋白激酶A是该途径下游的主要效应分子。本研究首先利用抑制剂试验初步确定了基因的功能,应用候选基因法和Genome Walking技术克隆了玉米大斑病菌的cAMP依赖性蛋白激酶A调节亚基基因(PKA-R)全长序列和催化亚基基因(PKA-C)同源片段,并对其进行了生物信息学分析、基因缺失突变体分析等方面的研究,为进一步明确cAMP信号转导途径在玉米大斑病菌致病过程中的作用提供了理论依据。 本文利用PKA特异性抑制剂H89处理玉米大斑病菌孢悬液,结果发现分生孢子的萌发和附着胞的形成均受到抑制。H89随着浓度的增加,对孢子萌发和附着胞形成的抑制作用明显增强;同一浓度下,抑制剂对附着胞形成过程的抑制作用大于孢子萌发过程。初步确定了PKA在病菌分生孢子萌发和附着胞的形成过程中起重要作用。 根据已知植物病原真菌PKA-R和PKA-C基因的保守核苷酸序列设计简并性引物,以玉米大斑病菌基因组DNA为模板,扩增获得了PKA-R和PKA-C基因的同源片段。利用Genome Walking技术对所得的基因片段进行延伸,获得了2688 bp的PKA-R基因全长序列和1382 bp的PKA-C基因片段。Southern杂交技术确定了PKA-R基因和PKA-C基因在玉米大斑病菌基因组中均以单拷贝形式存在。 生物信息学分析表明,PKA-C基因编码氨基酸序列与烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、小麦黄斑叶枯病菌(Pyrenophora tritici-repentis)等病原菌的PKA-C蛋白同源性达69%~85%;比对PKA-R基因DNA和cDNA序列发现,该基因没有内含子,开放阅读框为1398 bp,编码465个氨基酸残基;蛋白的分子量约为50.437 kD,等电点pI5.68,编码蛋白与小麦黄斑叶枯病菌(P. tritici-repentis)、小麦颖枯病菌(P. nodorum)、灰霉病菌(Botryotinia fuckeliana)等病原菌的PKA-R蛋白同源性达58%~88%。PKA-R蛋白为亲水性细胞质蛋白,没有预测到信号肽和跨膜结构,二级结构预测表明,PKA-R蛋白由α-螺旋(34.84%)、β-折叠(13.55%)、β-转角(4.52%)和随机卷曲(47.10%)组成。 为进一步研究基因功能,试验构建了PKA-R基因的双交换同源重组型基因敲除载体及PKA-C基因的RNA干扰载体。对PKA-C基因的RNA干扰载体质粒利用PEG介导法转化玉米大斑病菌的原生质体,潮霉素筛选共获得了11个转化子。以潮霉素磷酸转移酶基因hph为探针,经Southern杂交验证,确定了转化子m5-1为突变体。对突变体m5-1进行表型分析,发现其生长速率降低,菌丝节间变短,且不产生分生孢子。


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