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口蹄疫病毒VP1基因转染树突状细胞对T淋巴细胞的活化作用研究

李杰  
【摘要】: 口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMD virus, FMDV)引起偶蹄动物多发的一种急性、热性和传播极为迅速的接触性传染病。严重危害家畜的生产力和畜产品质量,给畜牧业和进出口贸易造成较大的经济损失,直接威胁着国际贸易和国家声誉及人类食品卫生,因而受到人们的普遍关注。目前,针对预防口蹄疫疾病的爆发和流行,多数发展中国家主要采用注射灭活病毒疫苗的方法。但灭活疫苗存在灭活不彻底和保护期短等缺点。因此,新型口蹄疫疫苗及免疫策略的研究已成为亟待解决的焦点问题。口蹄疫病毒衣壳由4种结构蛋白VP1,VP2,VP3,VP4各60个拷贝组成,VP1蛋白又称1D蛋白,其基因位于基因组的2977-3615,编码213个氨基酸。早期研究表明,结构蛋白VP1暴露在病毒颗粒的表面,是诱导产生中和抗体的主要成分。 本实验以质粒pMD18-VP1为模板,经过EcoRI和HindIII双酶切鉴定和基因序列测定得到FMDV的VP1基因,对目的基因和真核表达载体pcDNA3.1(+)分别以相同的限制性酶EcoRI和HindIII消化后,经T4连接酶连接构建重组质粒,转化宿主菌大肠杆菌DH5α后得到重组质粒,经酶切鉴定正确后,对重组质粒pcDNA3.1-VP1进行测序,结果表明,VP1基因定向克隆到表达载体pcDNA3.1中。将VP1基因与GenBank发表的序列进行同源性比较,证明本研究所用毒株与Foot-and-mouth disease virus O isolate O/NYOO基因编码序列(NCBI登陆号分别为AY333431.1)同源性最高,可达100%。结果证明pcDNA3.1-VP1重组质粒构建成功。为鉴定pcDNA3.1-VP1基因能否在真核细胞中表达,本研究用重组质粒pcDNA3.1-VP1转染小鼠的单核细胞源树突状细胞(MoDC),同时用空载体转染MoDC作为阴性对照。Western blot检测结果显示,在分子量约为60kD处有一条明显的蛋白条带,而空载体在相应位置未见蛋白条带。为了验证转染VP1的MoDC能否有效地激活淋巴结T细胞,本研究用转染VP1的MoDC和淋巴结T细胞组成共培养体系,以负载了灭活FMDV抗原的MoDC(FMDV+DC)与淋巴结T细胞作为阳性对照,以单纯的MoDC为阴性对照,用ELISA法检测不同时间点IFN-γ水平变化。结果显示,转染VP1的MoDC与负载了灭活FMDV的MoDC一样,均可有效地激活淋巴结T细胞,但转染VP1基因的MoDC可能激活的是淋巴结CD8+T细胞,并能诱导其释放大量的IFN-γ。这些试验结果为进一步研究DC提呈FMDV抗原机制和新型疫苗的开发奠定了重要基础。


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