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不同苹果品种S基因交互作用的分子及生理学研究

张雪梅  
【摘要】: 自交不亲和性(self-incompatibility)是植物防止近亲繁殖和保持物种连续性的一种重要机制,在植物界普遍存在。苹果(Malus domestica Borkh.)属于配子体自交不亲和类型,是由一个基因座上的复等位基因-S基因控制的,生产中必须配置具有不同S基因型的苹果品种作授粉树或用具有不同S基因型的苹果品种花粉进行人工辅助授粉,才能获得预期的产量和果实品质。快速、早期鉴定苹果品种花柱和花粉S基因型、弄清自花授粉后花柱生理指标变化、培育纯合基因型苹果品种已成为当前亟待解决的课题。我们于2004年~2008年对河北省近十年来新引进的28个苹果品种S基因型以及自交亲和苹果品种早红香花粉S基因型进行了鉴定,并对苹果自花授粉生理机制进行了研究,主要研究结果如下: 1.早红香苹果自花授粉花序坐果率为90.17%,确定为自交亲和品种,嘎拉、夏光、红奥、桑萨、金冠、富士和斗南自花授粉花序坐果率在30%以下,为自交不亲和品种;不同授粉组合花柱半离体试验表明:早红香苹果为自交不亲和强度弱的品种,金冠、富士和斗南3个品种为自交不亲和强度强的品种,与田间授粉试验结果一致。自交亲和的苹果品种早红香花粉萌发率与自交不亲和的苹果品种金冠和富士花粉萌发率均在92.62%以上,三者之间不存在差异,均极显著高于花粉萌发率仅为3.20%的斗南苹果。 2.早红香苹果开花前后花柱原位印记分析表明:开花前花柱核糖核酸酶活性较低,开花当天花柱核糖核酸酶活性较高。早红香苹果自花授粉后不同时间花柱原位处均出现白色印记,随着授粉时间的延长,从柱头至花柱基部印记强度逐渐减弱;苹果自花授粉后花粉管荧光显微观察表明:自花授粉后0~24h各个苹果品种花粉管均能正常生长,自花授粉24h后自交不亲和的苹果品种花粉管生长到花柱1/2即停止生长,自交亲和的苹果品种花粉管正常生长到胚囊。 3.根据PCR-RFLP并结合其亲本S基因型的方法,确定了早红香、静香、惠民短枝、红王将、赤岭、二岭、长甜、长红、苹果A、澳洲青苹、宫崎富士、秋幸、国红、昂林、松本锦、美国8号、华冠、南方脆S基因型,依次为:S1S9、S1S9、S1S9、S1S9、S30S30、S30S30、S30S30、S30S30、S30S30、S30S30、S1S9、S30S30、S1S9、S1S9、S1S9、S9S27、S9S9和S2S9.苹果品种烟嘎1、红金嘎拉、烟嘎2、阿斯、皇家嘎拉、高岭可以确定2条S基因中的1个,依次为:SXS27、SXS27、SXS27、SXS27、SXS27和SXS9。 4.通过DNA测序方法,从桑萨、烟嘎1、红金嘎拉、烟嘎2、青9号、阿斯、皇家嘎拉、静香、高岭、红奥、斗南11个苹果品种分离到10个新的S-等位基因,这些新基因DNA序列和推导的氨基酸序列中包括的C1区、C2区非常保守,没有碱基或氨基酸被替代、缺失的现象,其变异区主要是HV区和内含子区。高变区推导氨基酸序列的氨基酸替换率达17%~50%。将该10个新S-等位基因分别标记为:斗南(S33-)、静香(S34-)、红奥(S35-)、阿斯(S36-)、皇家嘎拉(S37-)、烟嘎1、烟嘎2和高岭(S38-)、红金嘎拉(S39-)、桑萨(S40-)、青9号(S41-、S42-),在GeneBank中的接收号依次为:DQ219464、EU310474、EU391605、EU391606、EU391607、EU391609、EU391610、EU391611、EU391612、EU391613。由PCR-RFLP技术和DNA序列分析确定了11个苹果品种的S基因型分别为:桑萨S40S40、烟嘎1S38S27、红金嘎拉S39S27、烟嘎2S38S27、青9号S41S42、阿斯S36S36、皇家嘎拉S37S27、静香S1S9S34、高岭S38S9、红奥S35S35、斗南S33S33。 5.自交亲和苹果品种早红香两条花柱S基因没有改变,花粉S基因SLF9?推导的氨基酸序列与SLF9相比只有8处发生变异,而SLF1?推导的氨基酸序列与SLF2相比除两个高变区有4个位点发生变异外还有19个位点发生变异,并且由P SLF1扩增得到的花粉S基因SLF1?经BLAST比较与MdSLF1的DNA序列相似性仅为83%,二者不一致的碱基分布于整个DNA序列中,因此自交亲和苹果品种早红香花粉SLF1?基因发生变异的可能性较大。 6.自花授粉后花柱生理活性研究结果表明:自花授粉后0~48 h自交亲和的苹果品种早红香花柱SOD、POD、CAT活性稳定。自交不亲和的苹果品种自花授粉后0~24h SOD、POD、CAT活性处于相对稳定的状态,该时间花粉管在花柱内能够正常生长。自花授粉后各时间段花柱MDA含量以自交亲和的早红香最高,但整体变化较小,且48~72h呈现下降趋势,而自交不亲和的苹果品种自花授粉后24~72h花柱MDA含量变化较大,并且48~72h MDA含量均呈现上升趋势。综合自花授粉后保护酶活性与MDA含量的变化可以看出,苹果自交是否亲和与保护酶活性及MDA含量的高低无关,而是与授粉后保护酶活性及MDA含量相对稳定性有关;自交亲和苹果品种早红香自花授粉后不同时间花柱蛋白质含量均极显著高于其它3个自交不亲和的苹果品种;不同苹果品种自花授粉后不同时间花柱R-Nase活性减弱的程度不同,其中自交亲和的早红香苹果开花当天至自花授粉后72h花柱R-Nase活性变化平缓,自交不亲和的苹果品种斗南开花当天至自花授粉12h花柱R-Nase活性直线减弱,而授粉后富士苹果花柱R-Nase活性减弱程度明显低于早红香苹果;自花授粉后24h自交亲和品种花柱GA3最高,自交不亲和品种花柱GA3含量则无明显变化,证明GA3对花粉管在花柱内生长起主导作用,较高的(IAA+GA3)/ABA值利于花粉管的生长,而ZT对花粉管在花柱内生长的作用不大;花柱IAA氧化酶活性随自花授粉后时间的延长而呈缓慢上升趋势,与自花授粉后花柱中IAA含量变化趋势相反,自交亲和的早红香苹果于自花授粉24h后花柱IAA氧化酶活性减弱。 7.培养基中加入不同浓度苹果花柱蛋白质后对其自花花粉萌发均有抑制作用,并且同一品种花粉萌发受抑制程度随培养基中花柱蛋白质浓度的提高而加强。自交亲和的苹果品种早红香培养基中加入花柱蛋白质后对花粉萌发及花粉管生长的抑制程度较自交不亲和苹果弱,花粉萌发率均在76.46%以上,花粉管长度在770.16μm以上;适宜浓度的外源Spm、Spd和Put处理自交不亲和苹果花柱后均能增加花柱伸出花粉管比率和每根花柱长出的花粉管数,自交不亲和苹果品种红奥、嘎拉、斗南、富士、金冠和夏光花柱最适宜的Spm浓度为0.1mM;适宜的Put浓度除金冠苹果为0.25mM外其它自交不亲和品种均为0.01mM;适宜红奥和富士苹果的Spd浓度为0.01mM,适宜斗南、金冠和嘎拉的Spd浓度为0.5mM,适宜夏光苹果的Spd浓度为0.25mM。 8.对早红香苹果田间自花授粉得到的种子进行胚培养,结果表明:长出真叶前留2片子叶,之后留一片子叶的胚成苗较好,留1片子叶的次之,不留子叶的较差;后代自交不亲和基因分离比例基本符合孟德尔分离定律,可以得到不同S基因型的子代纯合基因型个体,为建立苹果纯合自交不亲和基因体系、加速育种进程奠定了基础。


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