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对光肩星天牛幼虫高致病力绿僵菌菌株筛选及其致病机理研究

王达  
【摘要】: 应用绿僵菌防治光肩星天牛成虫及幼虫是光肩星天牛综合治理的一条重要途径。为了揭示绿僵菌对光肩星天牛幼虫的致病机理及控制潜能,明确绿僵菌与光肩星天牛幼虫的互作关系,本文以黄粉虫诱集法从土壤中诱集并筛选到对光肩星天牛幼虫具有较高致病力的绿僵菌MS01菌株,并系统研究了其生物学特性、对光肩星天牛的致病性及其影响因子(温度、湿度、传代方式及传代次数)、绿僵菌对光肩星天牛幼虫的入侵和致病过程、光肩星天牛幼虫对绿僵菌侵染的防御反应、光肩星天牛感染绿僵菌后的病理学变化。研究结果如下: 以黄粉虫为饵虫从采集的不同土壤样品中诱集分离到8株绿僵菌,并对光肩星天牛幼虫进行生物测定。结果表明,不同菌株对50 d龄光肩星天牛幼虫的致病力存在差异,其中以MS01菌株的致病力最高,校正死亡率和感染率分别为100%和83.33%,致死中时LT50为2.69 d。MS01菌株与市售菌粉经虫体复壮后对95 d龄光肩星天牛幼虫的生物测定结果表明,相对于市售菌株,MS01的复壮菌株致病力更高,至第8天校正死亡率达100%,感染率为90.4%,LT50为5.25 d。MS01菌株对95 d龄光肩星天牛幼虫的致死中浓度LC50为1.68×106孢子·mL-1。因此确认绿僵菌MS01菌株对光肩星天牛幼虫具有较高致病力。 通过生物学研究确定了MS01菌株营养生长和产孢的最适培养基为PPDA。该菌株在26℃下营养生长最好,28℃下产孢量最高、孢子萌发速度最快、萌发率最高。该菌株营养生长和产孢的最适相对湿度范围为95%~100%,相对湿度与孢子萌发速度、萌发率呈正相关,相对湿度100%时达到最高。 光肩星天牛成虫接种低、中、高三种浓度的绿僵菌MS01菌株后,其产卵量,卵的孵化率和孵化幼虫存活率均明显降低,且接种浓度与产卵量和孵化幼虫存活率呈负相关。MS01菌株对光肩星天牛幼虫产生致病作用的最适温度为26℃,最适湿度为100%。通过PPDA培养基传代2次后对菌株致病力无明显影响,传代4次后会导致菌株致病力的降低;而通过光肩星天牛幼虫传代培养会不同程度提高菌株的致病力。 扫描电镜和透射电镜观察表明,绿僵菌侵染光肩星天牛幼虫的主要部位是腹部节间膜,附着分生孢子数量较多、萌发较快、萌发率和侵入率较高;其次是气门附近区域。这两处是利于绿僵菌侵入的薄弱环节。接菌后12 h,分生孢子在光肩星天牛幼虫体表开始萌发并出现芽状突起,随后产生芽管和各种附着结构,接菌后16 h,寄主表皮层中观察到少量菌丝段,至24 h菌丝已普遍侵入,在入侵过程中芽管依靠机械压力和酶的共同作用进行穿透。36 h~48 h分生孢子即可穿透体壁进入血腔。菌丝和菌丝段经血淋巴循环侵入各器官组织。48 h~72 h,随着菌丝和菌丝段在肠壁细胞中迅速大量增殖,肠壁组织逐渐被破坏,中肠微绒毛脱落,肠壁细胞形成空泡,围食膜被分解消失,最终中肠组织崩溃、解体。 当幼虫被绿僵菌不同传代菌株接种后,其血淋巴酚氧化酶活性虽起伏变化但全部出现一个高峰值,表明寄主因受到绿僵菌入侵的刺激,其免疫互作使酚氧化酶活性上升至峰值,但随着菌株适应性的逐渐增强而使酚氧化酶活性呈现波动式下降。对接种不同菌株的幼虫血淋巴中酚氧化酶活性的差异显著性分析表明,相对于寄主传代的菌株,经培养基传代的菌株接种光肩星天牛幼虫后引起的血淋巴酚氧化酶活性较高。 光肩星天牛幼虫的血细胞对绿僵菌的侵入具有一定的防御能力,参与防御反应的血细胞主要是粒血细胞和浆血细胞,在防卫反应高峰期(48 h~72 h),血细胞总数急剧上升,粒血细胞和浆血细胞比例发生改变,同时血细胞出现粘附、聚集、吞噬、包被、形成结节或囊块等一系列的防御反应。但由于菌丝段在血液中的迅速增殖,血细胞防御机制对绿僵菌只起暂时的阻碍和抑制作用,最终反被其瓦解。 光肩星天牛成虫接种低、中、高三种浓度的绿僵菌MS01菌株后,其取食量明显降低,接种浓度与取食量呈负相关。光肩星天牛幼虫感染绿僵菌后,其取食量和体重均低于对照组;其血淋巴蛋白浓度虽波动较剧烈但总体呈不断下降趋势;光肩星天牛幼虫血淋巴中共检测出17种游离氨基酸,感染绿僵菌后不同时段,游离氨基酸总量呈现先下降后上升的变化趋势,不同种类的氨基酸含量变化情况不一致。 绿僵菌的侵染引发了光肩星天牛幼虫体内主要保护酶和解毒酶的活力发生了不同程度的改变。在染菌初期超氧化物歧化酶(SOD),过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活力迅速提高,在染菌后期SOD和POD活力有不同程度的下降,而CAT活力却上升到较高的水平。羧酸酯酶(CarE)活性变化表现为先上升而后又逐渐下降;谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活性变化总体表现为激活→抑制→激活→抑制;对乙酰胆碱酯酶(AchE)活力的影响,可归纳为抑制→激活→抑制→激活→抑制。 明确了光肩星天牛幼虫感染后组织病理变化及绿僵菌在寄主体内的发展过程。绿僵菌侵入后,首先使寄主表皮层和皮细胞层分离,进入寄主血腔后,随着菌丝在体腔内大量繁殖,受侵染的各器官和组织均发生明显的病变,如脂肪体松散、肌肉组织出现裂缝、气管组织解体破坏、马氏管变形、消化道解体等。


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