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木聚糖酶基因工程菌的构建及其酶学性质研究

赵男  
【摘要】: 木聚糖(Xylan)是植物半纤维素的主要成份,是继纤维素之后自然界中第二丰富的多糖,也是自然界中最为丰富的可再生资源之一。木聚糖酶属于水解酶类,可以将木聚糖降解成低聚木糖或木糖。近十年来,木聚糖酶在饲料、食品、制浆造纸工业中有着广阔的应用前景,已成为现代酶学研究的热点。本试验以疏棉状嗜热丝孢菌SY-2为出发菌株,研究了木聚糖酶xynA基因在毕赤酵母GS115中的表达。 本试验根据已报道的木聚糖酶(xynA)基因序列设计一对特异性引物,以疏棉状嗜热丝孢菌SY-2的总RNA为模板,利用RT-PCR的方法扩增xynA基因,将目的基因与克隆载体pMD18-T相连。经测序,该基因长585bp,编码194个氨基酸,理论分子量为24.4KDa。该基因序列已在GeneBank注册,登录号为GU166389。本序列经GeneBank中BLAST比对,与疏棉状嗜热丝孢菌U35436核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为99.49%和98.97%。因此可以认定此基因编码的为木聚糖酶。 将已经测序的xynA基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建酵母表达质粒pPIC9K-xynA,重组质粒pPIC9K-xynA经线性化后,采用电转化法转化毕赤酵母GS115。通过MD和MM平板、G418抗性平板、PCR方法筛选和鉴定转化子。通过测定重组酵母发酵上清液中的木聚糖酶活性筛到一株外源蛋白产量较高的重组酵母XY-79。通过对XY-79的生长规律和发酵条件的研究发现,外源基因的稳定性很好,即使在没有选择压力存在下,繁殖10代后,其外源基因的丢失率仍为零。 摇瓶发酵条件下诱导216 h,酶活达到113.5 IU/mL,蛋白含量达到889.7μg/mL。研究酶学性质发现,该酶最适作用温度为65℃,酶的最适作用pH为5.5。在55℃保温时,酶活力能保持85%以上。但65℃保温保温40min,酶活力仅剩45%。酶蛋白在pH2.5~8.5范围内活性比较稳定,酶活可以保持80%以上。当金属离子在反应体系中的终浓度为1 mmol/L时,Mg~(2+)、Ca~(2+)对木聚糖酶有促进作用,Na~+和K~+对酶有轻微的促进作用。当金属离子在反应体系中的终浓度为10 mmol/L时,所有金属离子对木聚糖酶都有不同程度的抑制作用,Ag~+、Cu~(2+)、Mn~(2+)抑制作用比较明显。以上与出发菌株酶学性质一致,表明真核表达对其酶学性质并没有造成影响。


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