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重组猪蛔虫抗菌肽Cecropin P1在毕赤酵母中的表达及抑菌活性的研究

李巍  
【摘要】: 抗菌剂在我国畜牧业生产中仍然作为重要的饲料添加成分而被广泛应用。这是因为在我国现有集约化畜牧业生产条件下,由于饲料本身、水源和环境等方面的因素,很难避免外界病原微生物通过各种途径侵入动物体内。所以为使动物健康的生长,在目前我国养殖业饲养条件下,在饲料中添加抗菌制剂来预防动物疾病的发生是必要的。然而在饲料中添加什么样的抗菌制剂,添加剂量多少,这不仅关系到动物的健康问题,更重要的是关系到畜禽产品的质量和生物安全性问题,也关系到自然界生态平衡的环境问题。所以动物饲料抗菌添加剂与其它促生长添加剂一样受到广大畜牧工作者和畜禽产品广大消费者的关注。 有鉴于此,研制“无毒,无残留,无耐药性”的新一代抗菌制剂是当前的发展趋势和要求。抗菌肽(Antimicrobial Peptide)是生物体免疫防卫系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性多肽活性物质,是生物体先天免疫的重要组成成分。由于其独特的抗菌机制,不会诱发细菌的耐药性,成为具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。 目前抗菌肽的制备主要有生物材料提取、化学合成和基因工程表达三种方法。由于天然材料中动物内源性抗菌肽的含量极其有限,不可能从动物脏器(如小肠)获得大量抗菌肽添加到饲料中;而化学合成法价格昂贵,不可能大规模生产;基因工程方法则是目前大量表达抗菌肽使其成为新一代肽类抗菌药物更为现实的途径,显示出其广阔的前景。 近些年,我国畜牧科技工作者非常重视动物抗菌肽的研究和开发,在抗菌肽的药效和抗菌肽的规模化生产方面进行了多方面的研究,如对昆虫(家蝇、蚕、蚯蚓等)和某些哺乳动物的抗菌肽进行了开发研究。实验表明蚕抗菌肽AD能抑制多种畜禽病病原,如猪水肿病毒、猪沙门氏菌、鸡大肠杆菌、鸭大肠杆菌和流产杆菌等。在断奶仔猪饲料中添加β-defensin-2可明显减轻断奶仔猪的腹泻。人们还发现猪小肠抗菌肽(混合物)对多种致病菌有不同程度的抑制作用,杀菌率达到60%-98%。 目前在国内作为添加剂生产应用的抗菌肽主要是蚕抗菌肽AD-酵母制剂、家蝇抗菌肽制剂,并在畜牧养殖业生产中获得了一定的抑菌效果。然而应用异种动物抗菌肽作为畜禽抗菌饲料添加剂存在一定的弊端,因为高等动物的抗菌肽具有物种“种”的专一性。因此本文以哺乳动物抗菌肽为研究对象,从猪肠道蛔虫中扩增天然的抗菌肽Cecropin P1基因,利用毕赤酵母表系统实现其在体外的分泌表达。 本实验根据已发表的基因编码序列设计引物,采用RT-PCR方法从猪肠道蛔虫中扩增出Cecropin P1基因,并将其插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K中α-因子信号肽下游的SnaBⅠ和NotⅠ位点之间,构建成Cecropin P1基因的酵母分泌型表达载体pPIC9K/Cecropin P1。载体经SalⅠ酶切线性化,通过电转移方法将线性化的pPIC9K/Cecropin P1质粒转化到组氨酸缺陷型的酵母宿主菌GS115中。然后利用以葡萄糖为碳源的培养基(MD)和以甲醇为碳源的培养基(MM)筛选出组氨酸His+型和甲醇利用正型(Mut+)酵母重组体,再经G418加压筛选得到高拷贝Cecropin P1重组酵母。经PCR检测证明Cecropin P1基因已整合到毕赤酵母的染色体中。重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,通过Tricine-SDS-PAGE检测,重组酵母能够分泌表达重组Cecropin P1,同时表达的Cecropin P1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑菌效果。综上所述,通过本研究,最终获得重组酵母工程菌,为Cecropin P1基因工程新制剂的生产和应用奠定了基础。


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